Gilaus filtravimo taikymo snukio ir nagų ligos vakcinos gamybos procese tyrimas
Pratarmė – kas yra snukio ir nagų liga
XIV amžiuje yra rašytinių duomenų apie panašią snukio ir nagų ligą Europoje. Snukio ir nagų liga yra ūmi, karščiuojanti, labai užkrečiama liga, kurią sukelia snukio ir nagų ligos virusas.
Klinikiniai suaugusių gyvūnų simptomai yra: padidėjusi kūno temperatūra, pūslės ir išopėjimas burnoje, pūslės ir išopėjimas kanopoje ir net kanopų lukštų išskyrimas, dėl ko sunku valgyti ir miegoti, svorio mažėjimas ir netgi ekonominės vertės praradimas ūkiniams gyvūnams. ;
Jaunų gyvūnų klinikiniai simptomai yra: pakilusi kūno temperatūra, miokarditas ir kiti simptomai, atsiradus, jaunų gyvūnų mirtingumas yra didelis.
Abstraktus
Per pastaruosius 500 metų snukio ir nagų liga ne kartą išplito visame pasaulyje, o daugybė kiaulių, galvijų, avių ir kitų naminių gyvūnų bei laukinių lygiapirščių kanopinių mirė arba susirgo, o tai smarkiai paveikė gyvulius. ir veislininkystės pramonė.
Siekiant ištirti giluminio filtravimo technologijos taikymą snukio ir nagų ligos vakcinos gamybos procese, buvo išbandytas ir palygintas paviršinio filtravimo ir giluminio filtravimo filtravimo efektyvumas bei apsauginis poveikis baktericidinei filtracijai. Ištirti didelio krūvio giluminio filtravimo pranašumai pašalinant ląstelių šiukšles. Išnagrinėtos atitinkamos skirtingo drumstumo ląstelių auginimo terpės filtravimo schemos.
Rezultatai parodė, kad giluminio filtravimo apkrova buvo 13,9 karto didesnė nei paviršinio filtravimo, filtro skysčio drumstumas sudarė tik 23,5% paviršiaus filtravimo, o vėlesnė 0.2um debakterializacijos apkrova buvo 7,2 karto didesnė nei paviršinis filtravimas. Naudojant specialų dervos ligandą, filtro skysčio drumstumas sudaro 38,6% įprasto giluminio filtro su tokio paties dydžio poromis, o tai yra naudinga siekiant apsaugoti paskesnį procesą. Rezultatai parodė, kad gilus filtravimas, ypač stiprus teigiamo krūvio gilusis filtravimas, gali būti veiksmingai taikomas gaminant SNL vakciną, todėl reikia nustatyti tinkamus filtravimo procesus skirtingoms auginimo terpėms.
Snukio ir nagų liga ir gilus filtravimas
Snukio ir nagų liga (SNL) yra ūmi, karščiuojanti ir užkrečiama porakanopių liga, kurią sukelia snukio ir nagų ligos virusas (SNL). Labiausiai šiai ligai jautrūs gyvūnai yra galvijai, kiaulės ir avys. Snukio ir nagų liga yra endeminė Azijoje, Afrikoje, Artimuosiuose Rytuose ir Pietų Amerikoje, labai dažnai ir greitai perduodama. Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacija (OIE) įvardija ją kaip pirmosios A kategorijos zoonozinę ligą, todėl reikalaujama, kad valstybės narės įtrauktų snukio ir nagų ligą į gyvūnų ligų, apie kurias reikia pranešti, sąrašą. Skiepijimas yra veiksminga specifinės SNL prevencijos priemonė. SNL inaktyvuota vakcina, pagaminta inaktyvuojant nepažeistą virusą inaktyvatoriumi, atlieka svarbų vaidmenį SNL prevencijoje ir kontrolėje.
Pačios FMDV antigeniškumas yra menkas, o viruso inaktyvavimas turi didelį poveikį jo antigenui. Todėl dabartinėje SNL vakcinos gamyboje didelio grynumo SNL vakcina gali užtikrinti antigeno kiekį ir vienetinės dozės grynumą, o tai ypač svarbu ir yra dabartinė vakcinacijos strategija. Tai kelia aukštus reikalavimus tolesniam virusų valymui. Be to, iki 2009 m. Kinijoje inaktyvuotos snukio ir nagų ligos vakcinos dažniausiai naudojo kultivavimo metodą, kai buteliukas sukasi ir klijuojamas prie sienos. Didėjant vakcinų paklausai, palaipsniui išryškėjo šio kultivavimo metodo trūkumai, reikalaujantys daug besisukančių buteliukų, mažo efektyvumo ir žemo ekspresijos lygio.
Todėl pastaraisiais metais ląstelių kultivavimo technologija pamažu keitėsi nuo ankstesnės prilipusios kultūros prie suspensinės kultūros, o viruso gamyba buvo žymiai patobulinta. Tačiau didėjant viruso gamybai, pakeitus auginimo režimą, buvo didesnis spaudimas tolesniam valymui, nes atitinkamai padidėjo auginimo proceso metu susidarančių ląstelių nuolaužų, šeimininko baltymų, šeimininko DNR ir kt. kelia papildomų reikalavimų tolesniam valymo pajėgumui.
Membraninio filtravimo technologija plačiai naudojama biologinių produktų, tokių kaip vakcinos, gamybos procese, tarp kurių nuolatinės srovės filtravimo technologija dažniausiai naudojama ligos nuodų surinkimo procese, siekiant atskirti netirpias priemaišas, tokias kaip ląstelių liekanos. Ankstyvajame FMDV išaiškinimo metu daugiausia buvo pritaikyta paviršiaus filtravimo technologija, kurią reprezentuoja sulankstomas membraninis filtro elementas. Keičiantis auginimo sąlygoms, padidėjus ląstelių nuolaužų priemaišoms, paviršinio filtravimo metu sunku pasiekti skaidrinimo efektą, o kadangi paviršiaus filtravimo apkrova yra maža, filtravimo medžiagų kaina tampa vis didesnė.
Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta pirmiau, gilusis filtravimas vis dažniau taikomas SNL atskyrimo procese su citolikais. Giluminio filtro medžiagą dažniausiai sudaro ilgi ir smulkūs pluoštai iš natūralių šaltinių, o filtro terpės suformuotas kanalas po plėvelės suformavimo dažnai būna labai vingiuotas, panašus į labirinto angos struktūrą. Priemaišų dalelės dažnai įstringa filtro viduje, o ne ant paviršiaus. Be to, filtro kanalo sienelė dažnai sugeria dalį itin smulkių dalelių priemaišų, veikiant elektrostatiniam poveikiui arba tarpmolekulinei jėgai. Apskritai giluminio filtravimo filtravimo mechanizmui būdingas mechaninis sulaikymas ir adsorbcija.
Nuolatinės srovės filtravimo metodas
Sumontuokite giluminio filtro plokštę prie nuolatinės srovės filtro įrenginio, išplaukite filtro plokštę buferiniu PBS virš 54 L/m2; Baigę plovimą, paleiskite peristaltinį siurblį, kad lėtai pumpuotų skystį, lėtai sureguliuokite siurblio greitį iki maždaug numatomo srauto ir filtruokite skystį. Užsirašykite filtravimo tūrį, laiką, slėgio skirtumą ir drumstumą filtravimo proceso metu. Filtratas buvo surinktas antigeno aptikimui.
Gilaus filtravimo privalumai
Paviršinis filtravimas yra technologija, kuri užfiksuoja daleles ant filtro medžiagos paviršiaus, kad būtų galima filtruoti. Filtravimo mechanizmas daugiausia pagrįstas dalelių dydžiu skysčio siete, didelės dalelės yra įstrigusios ant filtro membranos paviršiaus. Gilus filtravimas naudoja vidinius kanalus dalelėms perimti ir adsorbuoti gylyje. Šių dviejų palyginimo diagrama parodyta 1 paveiksle.
Tam tikro gamintojo snukio ir nagų ligos vakcinos inaktyvuotas tirpalas buvo iš anksto filtruojamas atitinkamai 0,45 um polipropileno paviršiaus membrana ir giliąja filtro plokštele, o po to filtruojamas 0,2 um baktericidiniu filtru. Filtravimo duomenys pateikti 1 lentelėje.
Snukio ir nagų ligos vakcina inaktyvuoto tirpalo drumstumas yra 77 NTU. Jei bakterijos filtruojamos tiesiogiai, daugybė ląstelių fragmentų neišvengiamai greitai užblokuos 0.2um filtro membraną, o tai turės įtakos 146S vidalelių perdavimui. Todėl prieš debakterializacinį filtravimą buvo sukurtas išankstinis filtravimas ir buvo lyginami du išankstinio filtravimo metodai – giluminis filtravimas ir paviršinis filtravimas. Filtravimui parenkama dvigubo sluoksnio giluminio filtro plokštė, apkrova 641 L/m2, o gilus filtras sumažina 77 NTU medžiagą iki 9,65 NTU, kuri yra skaidri ir ryški. 0.45um paviršiaus filtravimo apkrova yra tik 46 l/m2, o filtro skysčio drumstumas siekia 41 NTU, o tai netinkama išankstiniam filtravimui. Palyginus vėlesnę 0.2um debakterializuoto filtravimo apkrovą, debakterializuotos filtravimo membranos apkrova po giluminio filtravimo yra 655 l/m2, tai yra 7,2 karto didesnė už atitinkamą paviršinio filtravimo filtravimo apkrovą (tik 91 l/m2). .
146S bandymo rezultatai rodo, kad giluminio filtravimo sistemos išeiga yra didesnė nei paviršinio filtravimo sistemos. Giluminio filtravimo apkrova buvo 13,9 karto didesnė nei paviršinio filtravimo, filtro skysčio drumstumas buvo tik 23,5 %, palyginti su paviršinio filtravimo apkrova, o vėlesnė bakterijas šalinanti 0,2 um filtravimo apkrova buvo 7,2 karto didesnė nei paviršinis filtravimas. Todėl tiek sąnaudų, tiek derlingumo požiūriu giluminio filtravimo sistema yra žymiai geresnė nei paviršinio membraninio filtravimo sistema.
Stipraus teigiamo krūvio giluminio filtro privalumai
Teigiamo krūvio giluminio filtro plokštė ir stipraus teigiamo krūvio giliojo filtro plokštė buvo panaudotos norint palyginti inaktyvuotą snukio ir nagų ligos vakcinos tirpalą iš skirtingų šaltinių. Filtravimo rezultatai pateikti 2 lentelėje, o filtravimo greičio ir slėgio skirtumo kitimas filtravimo procese parodytas 2 spalvų išdėstyme.
Dviejų naudojamų giliųjų filtrų plokščių grupių diafragmos tikslumas yra toks pat, o apkrovos ir slėgio skirtumo pokyčio požiūriu našumas yra labai nuoseklus, o slėgio skirtumo kitimo kreivė 2 paveiksle iš esmės yra identiška.
Tačiau dėl filtro skysčio drumstumo skirtumas yra labai didelis. Įprastos teigiamai įkrautos dvigubo sluoksnio filtro plokštės filtro skystis yra 25 NTU, o stipriai teigiamai įkrautos gilaus sluoksnio filtro plokštės su ta pačia apertūra filtro skystis yra tik 9,65 NTU, tai yra tik 38,6% įprastos gilaus filtro plokštės. Taip yra daugiausia dėl specialaus dervos ligando stipraus teigiamo krūvio giluminio filtro plokštės filtro medžiagoje. Dėl stipriai teigiamos dvisluoksnės filtro plokštės drumstumas sumažėja iki mažiau nei 10 NTU, o ląstelių fragmentai yra visiškai adsorbuojami arba sulaikomi, o tai prisideda prie tolesnio ultrafiltravimo arba baktericidinio filtravimo proceso. Be adsorbcijos poveikio netirpioms ląstelių nuolaužoms, Yigzaw Y ir kt. taip pat pranešė apie stipriai teigiamai įkrautos giluminio filtro plokštės pašalinimo poveikį ląstelės šeimininko baltymui, o Dorsey N ir kt. pranešė apie stipriai teigiamai įkrautos giluminio filtro plokštės pašalinimo poveikį. ant DNR.
Snukio ir nagų ligos vakcinos supernatanto skaidrinimo filtravimo proceso nustatymas gilaus filtravimo būdu
Atlikus aukščiau pateiktą lyginamąjį paviršiaus filtravimo ir giluminio filtravimo tyrimą bei specialios stipraus teigiamo krūvio giluminio filtro plokštės skaidrinimo efektą, skirtingos filtravimo schemos turėtų būti suderintos su inaktyvuotu snukio ir nagų ligos vakcinos supernatantu, pagamintu pagal skirtingus metodus. kultūros sąlygos. Išcentriniam supernatantui su 3 skirtingais drumstumo, mažo, vidutinio ir didelio drumstumo sluoksniais giluminio filtravimo schema ir atitinkami filtravimo parametrai pateikti 3 lentelėje.
Mažo drumstumo išcentriniam supernatantui vieno sluoksnio gilaus filtro plokštė gali veiksmingai nuskaidrinti ir pašalinti nedidelį kiekį ląstelių nuolaužų. Vidutinio drumstumo išcentriniam supernatantui dvigubo sluoksnio gilaus filtro plokštė gali efektyviai nuskaidrinti, ypač stipraus teigiamo krūvio giluminio filtro plokštė gali sumažinti drumstumą iki mažiau nei 5 NTU; Didesnio drumstumo išcentriniam supernatantui kombinuotą filtro plokštę galima efektyviai nuskaidrinti. Nesvarbu, koks procesas, apdorojimo pajėgumas yra 500 ~ 800 L/m2, filtro skysčio drumstumas yra mažesnis nei 20 NTU, o tikslinis antigenas yra visiškai išgautas, tinkamas didelio masto gamybai.
Diskusija
Aštuntajame dešimtmetyje filtravimo terpėje buvo nurodyta nenaudoti asbesto medžiagų, nes asbesto medžiagose yra kancerogenų. Giluminio filtro medžiagoje nėra asbesto ir yra stipresnis teigiamas krūvis. Filtro medžiaga pagaminta iš medienos pluošto matricos ir filtravimo pagalbinės priemonės. Gamybos procese polimerinė derva naudojama pagrindiniams komponentams sujungti, o joje esančios teigiamo krūvio funkcinės grupės efektyviai suteikia giluminio filtro medžiagos krūvio adsorbcijos gebėjimą. Puikus adsorbcinio giluminio filtravimo efektyvumas sulaikant smulkias daleles parodytas 3 paveiksle.
Šiame eksperimente buvo pasirinkti skirtingi dervos komponentai ir skirtingos tikslios giluminio filtravimo medžiagos, siekiant paaiškinti FMDV kultūros tirpalo filtravimo testą, o palyginimo bandymas buvo atliktas naudojant paviršinį filtravimą. Rezultatai parodė, kad gilus filtravimas labiau tinka ląstelių nuolaužoms pašalinti nei paviršinis filtravimas, kuris buvo palankus tolesniam mikrobų krūvio kontrolės filtravimo įrenginiui (0.2um). Be to, lyginant stipraus teigiamo krūvio giluminio filtro plokštės ir įprastos teigiamo krūvio giluminio filtro plokštės filtravimo efektą, stipraus teigiamo krūvio filtro plokštė pasižymi stipriu drumstumo kontrolės gebėjimu, kuris gali sumažinti drumstumą iki mažiau nei 5 NTU. labai padeda pagerinti viso filtravimo proceso tvirtumą.
Viršutinis auginimo procesas turi didelę įtaką veikliųjų medžiagų derliaus nuėmimo etapams. Atlikus bandymus, šis eksperimentas galiausiai sukūrė keičiamo dydžio filtravimo schemą skirtingo drumstumo ląstelių kultūros terpėms, kuri turi tam tikrą pagrindinę reikšmę didelio masto gamybai.
„Guidling Technology“ pristatytas gylio filtras yra disko tipo filtro elementas, kuris yra efektyvus filtro elementas, kurio filtravimo medžiaga yra gilaus filtro kartonas, visiškai atitinkantis biofarmacijos norminius reikalavimus, daugiausia sukurtas ir pagamintas specialiai didelis kietas turinys, pvz., ląstelės ir ląstelių fragmentai, ir gali būti naudojamas žinduolių ląstelių kultūros skysčiui; Bakterijų ir mielių ląstelių lizato išvalymas; Ląstelės šeimininko baltymo (HCP) pašalinimas; Pašalinti virusą ir DN; Endotoksinų pašalinimas; Putų šalinimo priemonės pašalinimas.
Produktas turi mažo negyvo tūrio, linijinio stiprinimo, disko kapsulės struktūros, kompaktiškos konstrukcijos konstrukcijos privalumus ir gali būti naudojamas serijiniu būdu su kita įranga, nedideliu plotu, stabiliu srautu, ilgu tarnavimo laiku ir mažomis sąnaudomis.
