Monokloninių antikūnų virusų šalinimo tolesnio proceso tyrimas

Biotechnologijos produktams, gautiems iš ląstelių linijų, gali kilti viruso užteršimo pavojus – mastas priklauso nuo daugelio veiksnių, įskaitant preparato šaltinį, naudojamas žaliavas, gamybos sistemą, valymo reagentus ir pagalbines medžiagas. Virusų pašalinimo arba inaktyvavimo gamybos procese tyrimas yra pagrindinis žingsnis siekiant sumažinti patogeninių virusų jatrogeninio perdavimo galimybę ir taip sumažinti riziką, kuri yra būtina gaminių saugai. Prieš atliekant klinikinius tyrimus ir parduodant biologinius produktus, turi būti įrodyta, kad jų gamybos procesas gali pašalinti žinomus ir numanomus virusus.

 

01 Monokloninio antikūno produkto viruso saugos įvertinimas

Viruso pašalinimo gebėjimo tyrimas paprastai yra pridedant žinomo titro indikatoriaus virusą į tarpinį produktą skirtinguose gamybos etapuose, tada nustatomas liekamasis viruso titras mėginyje, apdorotame konkrečiu procesu, ir galiausiai įvertinama log redukcijos vertė (LRV). viruso titro. Proceso etapai, skirti LRV didesnis nei 4log10 arba lygus jam, paprastai laikomi veiksmingais viruso pašalinimo veiksmais. Procesas su LRV<41og10 can be considered as helpful to increase the total virus clearance in the production process. However, due to the limitations of virus verification, the process with LRV≤11og10 has little significance for virus removal, and its LRV value is not included in the total amount of the production process.

Taikant imituojamo gamybos proceso (sumažinto proceso) metodą, būtina parengti pagrįstą virusų pašalinimo/inaktyvavimo tyrimo ir bandymų planą, kiek įmanoma susietą su faktiniu gamybos procesu, ypač su efektyviais gamybos proceso etapais. Modeliuojamas procesas turi griežtai atitikti faktinį procesą pagal bandymo parametrus ir kontrolės sąlygas.

 

02 Paprastai nurodo virusus ir tikrinimo schemas

Dažni indikatoriniai virusai pateikti 1 lentelėje.

Tiriamajame naujų vaistų taikymo (IND) etape biotechnologiniam produktui reikalingi bent 2 modelių virusų viruso klirenso tyrimai, paprastai pasirenkant vieną retrovirusą (X-MuLV) ir vieną parvovirusą (MMV). Biologinių vaistų licencijos paraiškos (BLA) fazės metu virusų pašalinimo tyrimai paprastai atliekami naudojant 3-5 specifinius / nespecifinius virusus ir įvertinami 3-5 proceso etapai, siekiant įrodyti, kad produktas turi tinkamą saugos faktorių. virusų saugos perspektyva. Dėl skirtingų gairių šalyje ir užsienyje yra tam tikrų skirtumų tarp viruso pašalinimo patikrinimo veiksmų, naudojamų deklaracijoms. Dažniausiai naudojamos viruso pašalinimo tikrinimo schemos mAb gamybos procese pateiktos 2 lentelėje.

 

03 Virusų šalinimo galimybė tolesniuose procesuose

3.1 Tolesnių procesų galimybė pašalinti įvairius virusus

Nuo 2009 m. FDA pateikti monokloninių antikūnų produktai, skirti IND ir BLA, baltymų A afinitetinei chromatografijai, žemam pH, anijonų mainų chromatografijai AEX (srauto prasiskverbimo režimas), katijonų mainų chromatografijai CEX (surišimo – eliuavimo režimu) ir viruso klirenso patvirtinimui, išskyrus virusų filtravimas yra dažniausiai naudojamos indikatorinių virusų šeimos, o jų šalinimo efektų vidurkis ir diapazonas parodytas 1 paveiksle.

Retrovirusams, išskyrus CEX, kurio LRV yra apie 3log10 (kaip parodyta 1 paveikslo A juostinėje diagramoje), kiti procesai buvo patikimi (LRV didesnis nei 4log10 arba lygus jai). Herpesvirusai ir retrovirusai turi panašų klirensą ir LRV > 4log10 (kaip parodyta B juostinėje diagramoje 1 paveiksle). Maži be apvalkalo virusai, tokie kaip parvovirusas, yra sunkiau efektyviai pašalinami, yra atsparūs cheminiam apdorojimui ir nėra lengvai įstrigę filtrų (parodyta 1 paveikslo C juostinėje diagramoje). Tik AEX ir maži virusų filtrai buvo veiksmingi pašalinant parvoviridae (vidutinis LRV > 4log10).

1 paveiksle pavaizduoti procesai yra ProteinA, AEX (srauto prasiskverbimo režimas), CEX (sujungimo-eliuavimo režimas), žemo pH inaktyvavimas (neužbaigtas „prieš“ visišką „pašalinimą“) ir didelės bei mažos diafragmos deviruso filtravimas.

 

3.2 Paskesnių procesų įtakos virusų pašalinimo pajėgumui veiksniai

LRV reikšmių pasiskirstymas kiekvienam procesui parodytas 2 paveiksle. Tyrimai su 0 ~ 21og10 buvo priskirti žemai LRV grupei, o tie, kurių LRV vertė didesnė nei 6log10, lyginamajai analizei priskirti didelės LRV grupei.

 

3.2.1 ProteinA afininė chromatografija

Nebuvo reikšmingos koreliacijos tarp baltymo A proceso LRV vertės ir balanso / plovimo buferio, užpildo, eliuento sudėties ir eliuento pH vertės. Bendras mažos LRV grupės vardiklis yra tai, kad žaliava yra gana sudėtinga, todėl gali būti, kad sudėtinga žaliavos ir užpildo sąveika neigiamai veikia chromatografinės kolonėlės gebėjimą pašalinti virusus.

 

3.2.2 AEX (tekėjimo režimas)

Strauss ir kt. parodė, kad AEX mėginių pH ir laidumas gali turėti įtakos LRV. Tačiau Miesegaes et al statistiniai rezultatai parodė, kad, kaip ir ProteinA, AEX LRV (srauto įsiskverbimo režimas) neturėjo reikšmingos koreliacijos su skirtingais buferiais, užpildais, pH ir laidumu, o tai gali būti dėl pH ir laidumo optimizavimo. praneštos bylos proceso sąlygomis.

 

3.2.3 CEX (rišimas – eliuavimo režimas)

Viruso pašalinimas naudojant CEX procesą nėra pakankamai tvirtas. Nebuvo reikšmingos koreliacijos tarp LRV didelės LRV grupėje ir buferio, patirties lygio ar bet kokių chromatografinių kolonėlių savybių, tokių kaip kolonėlės aukštis ir dervos tipas. Tačiau didelio LRV tyrime naudotos pusiausvyros/pakrovimo ir eliuavimo pH vertės buvo mažesnės – 5,3±0,2; Žemos LRV grupėje pH buvo 6.0±0.2. Kitas veiksnys yra tai, kad druskos koncentracija buferyje taip pat gali sukelti LRV vertės skirtumą. Mažo LRV tyrime naudoto buferio druskos koncentracija buvo didesnė – vidutinė koncentracija įkrovimo/balansavimo tirpale buvo 290±120 mM, o eliuente – 340±70 mM, o didelio LRV tyrimo metu NaCl koncentracija buvo 58 ±27 mM ir 183±31 mM atitinkamai.

 

3.2.4 Žemo pH inaktyvavimas

Žemo pH procese pH yra pagrindinis proceso parametras, o 3,8 pH pakanka retroviruso inaktyvavimui laipsniu. Žemo LRV grupės pH buvo 3,9, o didelio LRV tyrimo pH buvo 3,4.

 

3.2.5 Virusų filtravimo pašalinimas

Tiek mažos, tiek didelės diafragmos filtrams MuLV pašalinimo LRV vertė buvo ne mažesnė kaip 2log10 ir tik 1% tyrimų buvo mažesnė nei 3log10 (parodyta 2 paveikslo h ir i stulpeliuose). Bendras retrovirusų klirensas naudojant didelės diafragmos virusų filtrus buvo mažesnis nei naudojant mažos diafragmos virusų filtrus (kaip parodyta 1 paveikslo C juostinėje diagramoje). Pagrindinė priežastis, turinti įtakos parvoviruso pašalinimo rezultatui, yra skirtingi filtrų tipai. Apskritai antivirusinis filtravimas gali patikimai pašalinti virusus.

Procesai yra baltymo A(a), AEX įsiskverbimo režimas (b), CEX surišimas – eliuavimo režimas (c), AEX surišimas Ⅰ eliuavimo režimas (d), žemo pH inaktyvavimas („neišsamus“ ir „visiškas klirensas)“ (e ~). g) ir didelio porų dydžio (h) ir mažo porų dydžio (i ~ j) deviruso filtravimas (kur a ~ i: retrovirusas; j: parvovirusas).

 

04 Virusų saugumo vertinimo naujovės ir iššūkiai

Nuolatinė plėtra ir naujovės tolesnių biofarmacijos procesų srityje neišvengiamai sukels naujovių virusų pašalinimo vertinime. Dėl ankstesnių ir paskesnių procesų, tokių kaip nuolatiniai bioprocesai, pažanga privertė įvertinti ir nustatyti veiksmingus ir patikimus virusų šalinimo procesus. Nepertraukiamo srauto metu tikimasi, kad tokie veiksmai kaip viruso inaktyvavimas ir virusų filtravimas bus atliekami paketiniu režimu. Nors chromatografinių procesų viruso pašalinimo galimybė nepertraukiamo srauto režimu neturėtų iš esmės skirtis nuo paketinio apdorojimo, ji turi būti pagrįsta duomenimis.

 

05 Outlook

Žvelgiant iš virusologinės saugos perspektyvos, puikią biofarmacijos pramonės saugą daugiausia galima sieti su tuo, kad pramonė griežtai laikosi trijų pagrindinių virusinės saugos strategijų: tinkamo medžiagų ir ląstelių banko šaltinių tiekimo ir testavimo, viruso pašalinimo įvertinimų dokumentavimo (viruso patvirtinimo tyrimai) ir procese vykstantys virusų tyrimai. Biologinių vaistų, pagamintų naudojant naujus ląstelių substratus, savybės gali keistis dėl skirtingos rizikos, todėl norint užtikrinti biologinių vaistų saugą, reikalingos geros rizikos valdymo strategijos. Guidling Technology turi patyrusią profesionalią techninę komandą, apimančią filtravimo procesą nuo mažo bandymo, bandomojo bandymo iki didelio masto gamybos, mūsų membraniniai ir membraniniai filtrai yra plačiai naudojami išankstiniam filtravimui, mikrofiltravimui, ultrafiltravimui, nanofiltravimo koncentracijai, ekstrahavimui ir atskyrimui; Mūsų daugybė produktų linijų, nuo mažų vienkartinio laboratorinio filtravimo iki į gamybą orientuotų filtravimo sistemų, sterilumo tyrimų, fermentacijos, ląstelių kultūros ir kt., užtikrina didesnį produktyvumą.

Jiuling užtikrinti produkto kokybę kaip pirmasis rodiklis, siekiant "sumažinti išlaidas, padidinti efektyvumą" kelyje tyrinėti, tikimės dirbti su jumis ateityje, kad susidurtų su pramonės iššūkiais ir siekti geresnio vystymosi.