Ultrafiltravimo / diafiltracijos koncentravimo procesas pasroviui: kaip veiksmingai užkirsti kelią tikslinių baltymų prasiskverbimui ir praradimui

Tolesnis ultrafiltravimo / diafiltracijos koncentravimo procesas: kaip veiksmingai užkirsti kelią tikslinių baltymų prasiskverbimui ir praradimui

Vėlesniuose rekombinantinių baltymų, kraujo produktų ir kitų biologinių medžiagų valymo procesuose ultrafiltravimas / diafiltravimas (UF/DF) naudojamas žaliavos koncentravimui, buferio mainams ir druskų bei mažų{0}}molekulių priemaišų pašalinimui. Atskyrimas pasiekiamas sijojant membraną: didelės molekulės, pvz., monokloniniai antikūnai (mAb), sulaikomi membranoje, o druskos, endotoksinai, laisvųjų ląstelių-šeimininkų baltymai (HCP) ir kitos mažos -molekulės priemaišos praeina per membraną ir pašalinamos permeate. Didinant procesą-pro membraną gali lengvai prarasti tikslinius baltymus, o tai tiesiogiai sumažina išeigą ir padidina partijos sąnaudas. Tam tikromis veikimo sąlygomis permeate gali būti aptiktas baltymas, todėl reikia greitai nustatyti, ar nutekėję komponentai yra nepažeisti tiksliniai mAb, suskaidyti / suskaidyti agregatai, ar ląstelės šeimininkės baltymai. Šis straipsnis yra padalintas į dvi pagrindines dalis: jame apžvelgiami tradiciniai proceso{7}kontrolės metodai ir kartu su eksperimentų planavimu (DOE) sukuriamas tvirtas proceso langas, paremtas keliais analitiniais metodais, siekiant nustatyti permeate aptiktų baltymų tapatybę.

 

 

I. Pagrindinės tikslinių baltymų prasiskverbimo per membraną priežastys UF/DF metu

1. Per didelis transmembraninis slėgis (TMP)
Kai slėgio skirtumas membranoje yra per didelis, sustiprėja tirpiklio pasipriešinimas, todėl kai kurie monomeriniai baltymai patenka į permeatą. Didinant mastelį-, tiekimo bake yra didesnis medžiagos kiekis, o slėgio svyravimai vamzdynuose yra ryškesni, todėl trumpalaikis viršslėgis labiau tikėtinas nei laboratoriniu mastu.

2. Netinkamas tangentinis srautas
Jei srautas per mažas, membranos paviršiuje susidaro tankus koncentracijos{0}}poliarizacijos sluoksnis, o vietinė baltymų koncentracija gali viršyti membranos tolerancijos slenkstį. Jei srautas yra per didelis, šlyties įtempis gali sukelti struktūrinį mAb skilimą, todėl susidaro mažesni baltymų fragmentai, kurie gali laisvai praeiti pro membranos poras.

3. Per didelė baltymų koncentracija žaliavoje
Kai baltymų koncentracija pašaruose yra per didelė, baltymai kaupiasi membranos paviršiuje ir kai kurie monomeriniai baltymai gali patekti į permeatą. Tai dažna didelės apimties-gamybos problema.

4. pH arba laidumas už proceso ribų
Pasikeitus baltymo įkrovos charakteristikoms, gali sumažėti jo hidratacijos spindulys ir matomas dalelių dydis, todėl membrana prasiskverbia į nenormalų.

5. Membranos kasetės senėjimas, didelis difuzinis srautas arba nepakankamas išankstinis{1}}kondicionavimas
Fiziniai membranos kasetės defektai gali tiesiogiai sukelti baltymų nutekėjimą ir kelti su įranga{0}}susijusią riziką. Pakartotinis CIP su stipriai šarminiais tirpalais gali palaipsniui pažeisti polietersulfono (PES) membranos medžiagą.

6. Per didelis diafiltracijos tūris
Ilgai trunkančio diafiltravimo metu, nuolatinis tirpiklio plovimas gali palaipsniui pašalinti nedidelius monomerinio baltymo kiekius.

 

II. Tradicinės praktinės priemonės, skirtos užkirsti kelią tikslinių baltymų prasiskverbimui ir praradimui

(A) Proceso parametrų valdymas

1. Kontroliuokite transmembraninį slėgį (TMP)
Apibrėžkite viršutinę įspėjimo apie slėgio ribą ir nustatykite blokavimo pavojaus signalus, kad išvengtumėte trumpalaikio didelio{0}}slėgio poveikio membranos sluoksniui. Nustačius pradinius parametrus nedideliu mastu, sumažinkite saugų darbinį slėgį didinant-gamybą ir rezervuokite atitinkamą proceso tolerancijos diapazoną.

2. Optimizuokite kryžminį srautą
Sukurkite stabilų ribinį sluoksnį ir sumažinkite koncentracijos poliarizaciją membranos paviršiuje per kryžminį srautą, taip sumažindami baltymų kaupimąsi membranos paviršiuje prie šaltinio.

3. Po koncentracijos apribokite galutinę koncentraciją
Nustatykite koncentracijos ribą, pagrįstą fizikinėmis ir cheminėmis baltymų savybėmis, ir venkite per didelės pašaro koncentracijos. mAb įprastinė galutinė koncentracija paprastai neviršija 50 mg/ml; kai kurių agregacijai linkusių{2}}mAb koncentracija turėtų būti toliau mažinama.

4. Kontroliuokite pašaro pH ir laidumą
Išlaikykite stabilų hidratuotų baltymo dalelių dydį ir venkite molekulių susitraukimų, kuriuos sukelia rūgščių/šarmų arba joninių stiprumo sutrikimų.

B) Įranga ir veikimo valdikliai

1. Prieš kiekvieną partiją atlikite membranos kasetės vientisumo bandymą
Prieš gamindami kiekvieną partiją, atlikite burbulo{0}}taško testą, kad nustatytumėte sutrūkinėjusius membranos pluoštus. Pažeistas membranos kasetes reikia nedelsiant išmesti, kad būtų išvengta nuolatinio baltymų nutekėjimo.

2. Standartizuokite CIP valymo procedūrą
Kontroliuokite NaOH koncentraciją ir kontakto laiką. Po stipriai šarminio valymo visiškai subalansuokite membranos medžiagą, kad sumažintumėte membranos porų deformacijos riziką.

3. Naudokite pakopinį diafiltravimą
Ankstyvoje stadijoje naudokite didelį buferio keitimą-, kad pašalintumėte druskas, ir sulėtinkite diafiltracijos srautą artėjant galutiniam taškui, kad sumažintumėte baltymų pasipriešinimą ir praradimą.

 

III. Proceso projektavimo erdvės sukūrimas naudojant DOE (QbD proceso apibūdinimas; taikoma IND pateikimui)

1. Faktorių atranka
Peržiūrėkite penkis pagrindinius UF/DF proceso parametrus (P): transmembraninis slėgis, tiekimo srautas, pradinė baltymų koncentracija, pašaro pH ir darbo temperatūra.
Atsako kintamieji: išlaikytas derlius, baltymų kiekis permeate, membranos srautas ir didelės -molekulinės- masės agregatų procentas.

Atlikdami reikšmingumo analizę, nustatykite pagrindinius veiksnius, kurie prisideda prie baltymų nutekėjimo.

2. Atsako paviršiaus modeliavimas
Pasirinkite keturis didžiausią reikšmę turinčius parametrus, kad sukurtumėte atsako paviršių ir analizuotumėte parametrų sąveiką. Esant daugeliui eksploatavimo sąlygų, vienas parametras gali likti kvalifikuotame diapazone, o dviejų parametrų derinys gali sukelti baltymų prasiskverbimą. Tokių sąveikos efektų negalima nustatyti atliekant tradicinius vieno-veiksnio--kartu{5}}eksperimentus. Remdamiesi modeliu, apibrėžkite veikiančią projektavimo erdvę. Kol proceso parametrai išlieka šiame diapazone, galima užtikrinti veiksmingą baltymų sulaikymą, o priemaišos pašalinamos diafiltruojant.

3. Blogiausio-atvejo iššūkis (reikalingas proceso apibūdinimui)
Norėdami imituoti gamybos kintamumą, pasirinkite proceso parametrus, esančius kraštutinėse veikimo ribose: maksimalus TMP, minimalus kryžminis srautas ir viršutinė{0}}ribinė baltymų koncentracija. Įsitikinkite, kad net esant ekstremalioms eksploatavimo sąlygoms, didelio masto tikslinių baltymų netenkama-, taigi atitinka CMC peržiūros reikalavimus.

 

IV. Keli analizės metodai, skirti identifikuoti baltymus, aptiktus prasiskverbimo medžiagoje, ir atskirti tikslinį mAb, skaidymo fragmentus ir HCP

Remiantis analitiniu efektyvumu, sąnaudomis ir reglamentuojančiais pateikimo scenarijais, metodus galima suskirstyti į dvi kategorijas: greitą atranką ir patvirtinamąjį testavimą. Pirmenybė turėtų būti teikiama greitiems metodams atliekant įprastinę proceso stebėseną; kai atsiranda nenormalių nukrypimų, reikia naudoti tikslius identifikavimo metodus.

1. UV spektrofotometrija (greitas internetinis patikrinimas; pageidautina įprastiniam parduotuvės{1}}grindų stebėjimui)
Surinkite permeatą ir išmatuokite jo A280 absorbciją. Tai gali tik nustatyti, ar baltymų yra permeate, ir negali atskirti baltymų rūšių. Jis daugiausia naudojamas įprastiniam proceso stebėjimui. Nuolat didėjanti A280 reikšmė rodo blogėjantį baltymų nutekėjimą, todėl reikia nedelsiant sustabdyti diafiltraciją ir ištirti procesą.

2. SDS-PUSLAPIO elektroforezė (dažniausiai naudojamas kokybinis identifikavimo metodas)
Naudokite redukuojančią ir ne{0}}redukuojančią elektroforezę ir palyginkite juostų pozicijas su tikslinio mAb žaliavoje:
1) Jei juostos padėtis visiškai atitinka tikslinį mAb, nepažeistas mAb prasiskverbė į membraną.
2) Jei atsiranda mažesnės -molekulinės- masės juostos, baltymas buvo hidroliziškai skilęs, todėl susidaro mAb fragmentai.
3) Jei juostos yra išsibarsčiusios keliomis įvairiomis juostomis, dauguma jų yra šeimininko ląstelių baltymai (HCP) iš E. coli/CHO ląstelių-šeimininkų, o ne tikslinis produktas.

3. Didelio-našumo dydžio-išskyrimo chromatografija (HPSEC)
Atskirkite komponentus pagal molekulinį dydį ir palyginkite jų eliuavimo trukmę su žaliavos chromatogramos trukme:
- Pagrindinė smailė, kurios sulaikymo laikas yra toks pat kaip ir mAb, rodo nepažeistą tikslinį baltymą.
- Anksčiau eliuuojanti smailė rodo didelės-molekulinės-masės agregatus / fragmentus.
- Vėliau eliuuojanti smailė rodo mažos-molekulinės-masės skilimo fragmentus.
- Būdingos pagrindinės smailės nebuvimas rodo HCP priemaišų baltymus.
Šis metodas gali pateikti kiekybinius duomenis ir gali būti įtrauktas į proceso nukrypimų tyrimo ataskaitas; jis turi didelį pripažinimą klinikinio pateikimo medžiagoje.

4. HCP šeimininko-ląstelių baltymo ELISA rinkinio tyrimas
Jei permeate aptinkamas baltymas, ELISA rezultatas yra padidėjęs, o HPSEC nerodo būdingo mAb smailės, iš esmės galima nustatyti, kad nutekėjusi medžiaga yra CHO šeimininko{0}}ląstelių baltymai. Tai rodo nepilną priemaišų pašalinimą prieš srovę valant; priemaišos yra išplaunamos UF/DF stadijoje ir nereiškia produkto praradimo.

5. Afininės chromatografijos patikra (baltymų A chromatografija)
Baltymas A specifiškai suriša mAb Fc sritį. Permeato mėginį įdėkite į kolonėlę: būdingos eliuavimo smailės atsiradimas rodo nepažeisto tikslinio antikūno buvimą; eliuavimo smailės nebuvimas rodo, kad visi permeate esantys baltymai yra priemaišų baltymai.

6. Masių spektrometrija (LC-MS) (išsamus atsekamumas; naudojamas pagrindiniams proceso nukrypimams tirti)
LC-MS gali tiesiogiai analizuoti aminorūgščių seką ir tiksliai nustatyti baltymo kilmę. Jis daugiausia naudojamas sunkiems ar neįprastiems nukrypimams tirti ir nenaudojamas kaip įprastas proceso kontrolės testas-.

V. Korekciniai veiksmai, atitinkantys skirtingus analizės rezultatus

1. Permeate aptiktas nepažeistas tikslinis mAb
Sumažinti transmembraninį slėgį ir galutinę koncentraciją po koncentracijos; susiaurinkite proceso veikimo diapazoną pagal DOE rezultatus; ir patikrinkite membranos kasetės vientisumą.

2. Permeate aptikti antikūnų skilimo fragmentai
Ištirti šlyties įtempį viso proceso metu ir kraštutinius pH; optimizuoti prieš srovę vykstantį viruso inaktyvavimo etapą, kad sumažėtų baltymų skilimas.

3. Permeate aptikti tik HCP priemaišų baltymai
UF/DF parametrų koreguoti nereikia. Atsekite problemą iki ankstesnių chromatografijos etapų ir pagerinkite priemaišų pašalinimą afiniteto ir jonų mainų -mainų chromatografijos metu.

 

VI. Santrauka

Siekiant užkirsti kelią baltymų nutekėjimui UF/DF metu, tradicinis proceso valdymas remiasi istorine patirtimi, kad būtų apibrėžti atskiri taško parametrai, kurie gali tinkamai užtikrinti tik stabilią mažo masto gamybą. Siekiant užtikrinti stabilų našumą laipsniško proceso masto-didinimo metu, DOE-pagrįstas proceso apibūdinimas turėtų būti naudojamas proceso projektavimo erdvei su pakankamu tolerancija sukurti. Intervalų{5}}parametrų valdymas gali kompensuoti gamybos kintamumą. Kai baltymas aptinkamas permeate, paprasta UV aptikimo sistema gali pateikti pradinį įspėjimą, o po to atliekama elektroforezė, HPSEC ir ELISA atsekamumui ir identifikavimui. Tai leidžia tiksliai atskirti tikslinį produktą ir pagrindinio{8}}ląstelių priemaišas, leidžiančią tikslinę šakninę-priežastį ištirti ir imtis korekcinių veiksmų. Tai taip pat yra standartizuotas tyrimo komponentas, šiuo metu įtrauktas į mAb projektų CMC dokumentaciją.