Išsami MRNA vaistų gamybos proceso analizė: kaip TFF technologija sprendžia valymo problemas
Pastaraisiais metais mRNR technologija padarė pažangą biofarmacijos srityje, parodydama didžiulį taikymo potencialą, ypač vakcinose ir genų terapijoje. Sėkmingas mRNR vakcinų kūrimas ne tik suteikė naujų sprendimų infekcinių ligų prevencijai ir kontrolei, bet ir paskatino vėžio imunoterapijos bei personalizuotos medicinos pažangą. Kadangi tai yra nauja terapinių produktų klasė, didelio masto mRNR gamyba yra labai sudėtinga, apimanti RNR stabilumo kontrolę, likusių fermentų pašalinimą ir produktų reakcijos pašalinimą, buferio keitimą ir aukšto-grynumo atkūrimo rodiklių pasiekimą, o tam reikalingos gamybos technologijos su reguliavimo{5}}patvirtintais sprendimais.
MRNR vakcinų arba terapinių preparatų gamybos procesas daugiausia skirstomas į tris etapus: plazmidės DNR masinio tirpalo paruošimas, masinio mRNR tirpalo paruošimas ir mRNR-LNP vaistinio preparato paruošimas.
mRNR vaistų gamybos proceso schema
Tangentinis srauto filtravimas (TFF), kaip -nustatyta membranų atskyrimo technologija, plačiai taikoma mRNR gamyboje dėl didelio -efektyvumo molekulinio sijojimo, kontroliuojamo buferio mainų ir mažų šlyties įtempių savybių. Remiantis membraninio modulio konstrukcija, įprastos TFF konfigūracijos apima plokščias-lakštų kasetes ir tuščiavidurius{4}}pluošto modulius. Be to, slėgio -varomas membranos atskyrimas TFF gali būti klasifikuojamas į mikrofiltravimą (MF), ultrafiltravimą (UF), nanofiltravimą (NF) ir atvirkštinį osmosą (RO) pagal membranos porų dydį, palaipsniui didėjant selektyvumui.
TFF vaidina lemiamą vaidmenį keliuose mRNR vaistų gamybos etapuose, įskaitant plazmidės DNR masinės masės paruošimą, masinės mRNR gamybą ir galutinę mRNR-LNP vaistų produktų formulę. Tinkamai parinkus membranos tipą, molekulinės masės ribą (MWCO) ir membranos medžiagą, TFF leidžia efektyviai pašalinti reakcijos iš -produktų ir mažos-molekulinės- masės priemaišas, taip pat palengvina buferio mainus ir koncentraciją prieš ir po LNP inkapsuliavimo. Tai žymiai padidina RNR grynumą, stabilumą ir bendrą proceso mastelį.
Be to, tangentinio srauto filtravimo veikimą įtakoja sistemos konfigūracijos veiksniai, tokie kaip siurblio tipas ir vamzdžių konstrukcija, taip pat pagrindiniai proceso parametrai, įskaitant transmembraninį slėgį (TMP), šlyties įtempį ir filtravimo srautą. Šie veiksniai turi būti kruopščiai atrinkti ir optimizuoti, atsižvelgiant į tikslinio produkto savybes, ypač jautriems įtempiams produktams, tokiems kaip mRNR-LNP, kurie apdorojimo metu yra labai jautrūs išorinėms mechaninėms jėgoms.
Plazmidinės DNR gryninimas
Plazmidinės DNR pradinio tirpalo paruošimas iš esmės grindžiamas transkripcijos šablono sekos dizainu. Paruošimo metodai paprastai apima plazmidės DNR amplifikaciją, nors galima naudoti ir PGR amplifikaciją. Kaip pavyzdį imant DNR amplifikaciją, sukurtaE. colidažniausiai naudojamas fermentacijai{0}}pagrįstai amplifikacijai. Tolesnis gryninimo procesas daugiausia apima ląstelių surinkimą, lizę ir skaidrinimą, koncentravimą ir buferio keitimą, sterilų filtravimą, linijavimą ir chromatografinį gryninimą. Pramoninėse aplinkose ląstelėms surinkti dažnai naudojama nuolatinio srauto centrifuga, tačiau ji sukuria palyginti dideles šlyties jėgas. Tuščiavidurių pluoštų sistemos, turinčios atvirus kanalus ir mažą šlyties jėgą, labiau tinka tvarkyti mėginius su dideliu kietųjų medžiagų kiekiu, dideliu klampumu arba jautrumu šlyčiai, pavyzdžiui, plazmidinę DNR. Po surinkimo ląstelės homogenizuojamos aukštu-slėgiu, ultragarsu arba šarminiu būdu lizuojamos, o po to iš anksto nuskaidrinami giluminio filtravimo būdu.
Siekiant palengvinti tolesnę chromatografiją, koncentruojant ir keičiant buferį dažnai pirmiausia naudojamas tangentinis srauto filtravimas (TFF), naudojant membranines kasetes arba tuščiavidurio pluošto kolonėles, kurių molekulinės masės ribos yra 30 kDa, 100 kDa arba 300 kDa. Tai sumažina mėginio tūrį ir tuo pačiu pašalina kai kurias priemaišas, tokias kaip RNR, ląstelės šeimininko baltymai (HCP) ir šeimininko ląstelės DNR fragmentai (HCD). Chromatografija yra pagrindinis gryninimo etapas. Paprastai anijonų mainų chromatografija (AEX) derinama su hidrofobinės sąveikos chromatografija (HIC), kad būtų efektyviai pašalinamos priemaišos ir praturtinama labai bioaktyvi superspiraliuota plazmidinė DNR, taip žymiai pagerinant plazmidės grynumą.
Po išgryninimo plazmidė vėl veikiama TFF, kad tirpalas būtų sukoncentruotas iki tikslinės koncentracijos (paprastai 0,5–2 mg/ml) ir būtų atlikta dializė su galutiniu saugojimo buferiu. Šiuo etapu pašalinamos druskos ir organinių tirpiklių likučiai iš proceso, užtikrinant, kad buferio sistema atitiktų tolesnių in vitro transkripcijos (IVT) reakcijų reikalavimus.
In vitro transkribuotos (IVT) mRNR gryninimas
In vitro transkripcija (IVT) ir modifikavimas yra pagrindiniai procesai ruošiant mRNR pradinius tirpalus. IVT mRNR gamybos metu taikomas tangentinio srauto filtravimo (TFF1) – chromatografijos – tangentinio srauto filtravimo (TFF2) derinys. Ši strategija užtikrina veiksmingą ir kokybišką mRNR valymą, o tai yra svarbi vakcinos gamybos palaikymas.
Pasibaigus transkripcijos ir modifikavimo reakcijoms, paprastai pirmiausia atliekama ultrafiltracija / diafiltracija naudojant membranines kasetes arba tuščiavidurio pluošto kolonėles, kurių molekulinės masės ribos yra 30 kDa, 100 kDa arba 300 kDa. Šis veiksmas efektyviai pašalina įvairias su procesu susijusias priemaišas iš reakcijos sistemos, pvz., RNR polimerazę, likusius DNR fragmentus, nesureagavusius NTP, fiksuojančius fermentus, dvigubą -grandinę RNR (dsRNR) ir mažų{7} molekulių inhibitorius, tuo pačiu užtikrinant buferio mainus. Po vieno tangentinio srauto filtravimo etapo dauguma priemaišų efektyviai pašalinamos, o vienintelė aptinkama likutinė baltymų priemaiša yra RNR polimerazė.
Vėliau tolesniam gryninimui taikomi keli chromatografijos metodai. Dažniausiai naudojami metodai yra afininė chromatografija, dydžio-išskyrimo chromatografija, jonų-porų atvirkštinės-fazės chromatografija ir jonų -mainų chromatografija. Dėl šio ultrafiltravimo ir nuoseklios chromatografijos derinio mRNR pasiekia aukštą grynumo lygį.
Kad būtų patenkinti formulavimo ar laikymo reikalavimai, pradinis mRNR tirpalas vėl koncentruojamas arba atskiedžiamas naudojant 30 kDa, 100 kDa arba 300 kDa membranų kasetes arba tuščiavidurio pluošto kolonėles, kad būtų tiksliai sureguliuota tikslinė koncentracija ir pakeičiama į galutinį preparato buferį. Galiausiai, siekiant kontroliuoti mikrobų kiekį, taikomas sterilus{4}}laipsnio filtravimas, užbaigiamas laikinas medžiagos saugojimas ir užpildymas.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
mRNR{0}}LNP formulių gryninimas
Lipidų nanodalelės (LNP) šiuo metu yra plačiausiai ištirta mRNR terapijos tiekimo sistema. Šiuo metu įvairios mRNR{1}}LNP kompozicijos yra skirtinguose ikiklinikinio ir klinikinio vystymosi etapuose. LNP yra labai jautrūs gamybos procesams. Tarp vieneto operacijų, reikalingų mRNR-LNP gamybai, koncentracijos ir buferio keitimas naudojant tangentinį srauto filtravimą (TFF), taip pat sterilų filtravimą, kelia didelių iššūkių. Šie veiksmai turi būti kruopščiai optimizuoti, kad būtų užtikrintas proceso mastelio keitimas ir produkto kokybė, kartu išvengiant tokių problemų kaip membranos užsiteršimas ir netinkamas filtro įkėlimas.
Po mRNR inkapsuliavimo gryninimui naudojamas tangentinis srauto filtravimas (TFF). Šio žingsnio tikslas yra pašalinti neįkapsuliuotą mRNR, laisvus polimerus arba lipidines medžiagas, taip pat tirpiklių likučius iš mRNR ir lipidų. Kadangi mRNR-LNP yra ribotas stabilumas kambario temperatūroje, tolesnių procesų, įskaitant TFF, optimizavimas yra labai svarbus siekiant išlaikyti produkto kokybę.
Pagrindinės optimizavimo kryptys apima: tinkamą transmembraninio slėgio (TMP) ir tangentinio srauto greičio nustatymą pagal dalelių dydį ir mRNR{0}}LNP stabilumą, kad būtų subalansuotas filtravimo efektyvumas ir dalelių įtempis; membranų arba tuščiavidurių pluoštų kolonėlių su tinkamomis molekulinės masės ribomis (MWCO, pvz., 100 kDa arba 300 kDa) parinkimas, kad būtų veiksmingai pašalinta laisva mRNR, priemaišos ir mainų buferis, kartu sumažinant dalelių adsorbciją arba pažeidimą; ir koncentracijos bei diafiltravimo tūrių optimizavimas, siekiant užtikrinti veiksmingą buferio keitimą į tikslinę kompoziciją ir kontroliuoti galutinę dalelių koncentraciją bei dispersiškumą.
Be to, proceso metu reikia atidžiai stebėti svarbius kokybės atributus (pvz., dalelių dydį, polidispersiškumo indeksą [PDI] ir mRNR kapsuliavimo efektyvumą), o parametrus dinamiškai koreguoti pagal realaus laiko duomenis, kad būtų užtikrintas stabilus, keičiamo dydžio ir efektyvus mRNR-LNP valymas ir formulavimas.
Be to, dėl mRNR{0}}LNP ir jų komponentų nestabilumo taikant galutinio sterilizavimo metodus, bakterijoms ir kitiems mikrobiniams teršalams pašalinti paprastai naudojamas 0,2 µm sterilus -klasės filtras.