Trumpas kelių unikalių tuščiavidurių pluoštų inkliuzinio kūno valymo metodų aptarimas

Inkliuziniai kūnai (IB) yra didelio tankio, netirpios baltymų dalelės, suvyniotos į membranas, susidariusias, kai prokariotinėse ląstelėse, ypač Escherichia coli, ekspresuojami svetimi genai. Kai stebimas mikroskopu, IB yra didelės refrakcijos sritis, kuri akivaizdžiai skiriasi nuo kitų citoplazmos komponentų.

Inkliuzinio kūno formavimasis yra gana sudėtingas, susijęs su baltymų gamybos citoplazmoje greičiu, naujai sukurtų peptidų koncentracija yra didelė, todėl nėra pakankamai laiko susilankstyti, kad susidarytų amorfiniai baltymų agregatai. Inkliuziniai kūnai iš esmės sudaryti iš baltymų, iš kurių daugiau nei 50 % yra klonuoti produktai. Pirminė šių gaminių struktūra yra visiškai teisinga, tačiau trimatė konfigūracija neteisinga, todėl nėra biologinio aktyvumo. Inkliuzo kūno dydis yra 05-1μm, netirpsta vandenyje, tirpsta tik denatūrantuose, tokiuose kaip karbamidas, guanidino hidrochloridas ir kt.

E. coli inkliuziniai kūnai gali atsirasti dviejose ląstelės vietose: citoplazmoje ir periferinėje citoplazmoje. Inkliuzinių kūnų vieta ir savybės ląstelėje priklauso nuo baltymų ekspresijos.

E. coli citoplazmoje esančių inkliuzų skersmuo paprastai svyruoja nuo {{0}},2 iki 1,5 μm, o skirtingų baltymų skersmuo yra skirtingas, pavyzdžiui, interferono dydis yra 0,811 μm, o prorennet yra 1,281 μm. Kai kuriais atvejais kai kurių inkliuzų kūnų skersmuo yra didesnis nei E. coli skersmuo, o tai suteikia E. coli išsikišimą. Apskritai ląstelė turi tik vieną inkliuzinį kūną.

 

Inkliuzinio kūno valymas

 

Įtraukimo kūno valymo procesas paprastai yra:

Ląstelių smulkinimas:

Bendra ląstelių smulkinimo technologija yra: greitas audinių smulkinimas, stiklo homogenizatoriaus homogenizacija, ultragarsinis apdorojimas, pakartotinis užšaldymo-atšildymo metodas, cheminis apdorojimas (dažniausiai naudojant lizocimą).

 

Inkliuzinis kūno plovimas:

Inkliuziniai kūnai yra neaktyvios kietos dalelės, susidarančios tarpląsteliniu būdu agliutinuojant bakterijų ekspresuojamus baltymus, kurie dažniausiai egzistuoja amorfinėje, netirpioje formoje. Inkliuziniame kūne tikrasis tikslinis baltymas sudaro tik apie 50%, o likusioje dalyje yra lipidų, lipopolisacharidų, nukleorūgščių ir heteroproteinų, kurie yra prijungti prie inkliuzinio kūno ir turi įtakos inkliuzinio kūno baltymo renatūracijai. Todėl plovimas prieš denatūravimą yra labai reikalingas žingsnis.

Be to, inkliuzinių kūnų plovimas padeda padidinti rekombinantinių baltymų perlankstymo išeigą. Pašalinus priemaišas, galima sumažinti renatūracijos proceso kliūtis, kad baltymas būtų veiksmingiau sulankstytas ir teisingai surinktas, taip pagerinant baltymo aktyvumą ir funkciją.

Skalbiant dažniausiai naudojamas mažiau nei 1 % neutralių ploviklių, tokių kaip Tween, Triton, Karbamidas ir NP40 plius EDTA ir reduktorius 2-merkapotreitolis (DTT), -merkaptoetanolis, kartojamas daug kartų, nes ploviklio skalbimo pajėgumas padidinamas padidėjus tirpalo joniniam stiprumui, plaunant inkliuzinius kūnus galima pridėti NaCl, kad padidėtų jonų stiprumas.

Inkliuziniai kūnai gali būti naudojami kitiems ląstelių skilimo tirpalo komponentams pašalinti centrifuguojant arba filtruojant, kurie abu naudoja skirtingas inkliuzinių kūnų fizines savybes.

 

Centrifugavimas:

Inkliuzinio kūno baltymai yra daug tankesni nei tokio pat tūrio ląstelių fragmentai, todėl inkliuzinis kūnas gali būti atskirtas nuo likusios ląstelės centrifugavimo būdu. Nepertraukiamas centrifugavimas yra dažniausiai naudojama inkliuzinių kūnų gavimo pramoninėje gamyboje operacija. Kadangi ląstelių fragmentų tankis yra mažesnis nei inkliuzinio kūno, nusėdimo greitis yra mažesnis nei inkliuzinio kūno. Nepertraukiama suspensija ir centrifugavimas gali centrifuguoti didžiąją dalį inkliuzinio kūno, o ląstelių fragmentai palaipsniui pašalinami.
Filtravimas (tangentinis srauto filtravimas): dėl skirtingų inkliuzinių kūnų ir tirpių baltymų molekulinių dydžių galima naudoti filtravimo metodą, kuris gali sumažinti eksploatavimo išlaidas ir palengvinti jo mastelį. Tangentinį srauto filtravimą (TFF) lemia transmembraninis slėgio skirtumas. Medžiagos ir priemaišos, mažesnės nei membranos porų dydis, praeina pro membraną, o priemaišos, tokios kaip ląstelės su didesnėmis dalelėmis, yra sulaikomos. Paprastai filtravimo plovimui naudojama membranos anga yra 0,1 μm. Tuščiavidurio pluošto tangentinio srauto mikrofiltravimas gali tiesiogiai susidoroti su dideliu skystos medžiagos kieto kiekiu, mažiau žingsnių, paprastas veikimas, membraną galima pakartotinai naudoti valant, sumažinant investicijas į įrangą ir eksploatavimo išlaidas, atsižvelgiant į modulinės automatizuotos gamybos reikalavimus.

 

Toliau pateikiamas inkliuzinio korpuso plovimo, naudojant Guidling tuščiavidurio pluošto kolonėles, taikymo atvejis.

250 ml skysčio sukoncentravimui naudojome 94 cm{1}}.1-0.45 μm tuščiavidurį pluoštą (tikslinė baltymo molekulinė masė 17 kd). Viso plovimo proceso metu buvo tiriamas tikslinio baltymo atsigavimo greitis ir membranos srauto išeikvojimas.

0-71min yra koncentravimo procesas, 71-224min yra plovimo ir filtravimo procesas. Viso mikrofiltravimo proceso metu TMP palaipsniui didėjo, skysčio įleidimo greitis nepasikeitė, o vidutinis medžiagos srautas buvo 12LMH.

Rezultatai parodė, kad tikslinis baltymas buvo visiškai įstrigęs, o tikslinio baltymo atkūrimo greitis buvo didesnis nei 90%. Vedančios tuščiavidurio pluošto kolonos yra stabilios ir tinkamos šiam pritaikymui.

 

Įtraukimo kūno tirpimas:

Inkliuziniai kūnai paprastai ištirpinami denatūruojant karbamidą arba guanidino hidrochloridą, o ištirpę inkliuzų kūno baltymai yra visiškai denatūruojami, tai yra, išskyrus pirminę struktūrą ir kovalentinius ryšius, visi vandeniliniai ir hidrofobiniai ryšiai yra sunaikinami ir hidrofobiniai. šoninės grandinės yra visiškai atviros.

Karbamidas ir guanidino hidrochloridas yra vidutinio stiprumo denatūrantai, kurie lengvai pašalinami dializės ir ultrafiltravimo būdu. Bendra karbamido koncentracija 8-10M, guanidino hidrochloridas 6-8M. Karbamido tirpinimas turi nejonizacijos privalumus, neutralus, nebrangus, baltymų pašalinimas po renatūracijos nesukels didelio kiekio baltymų nusodinimo, o ištirpusius inkliuzinius kūnus galima išvalyti įvairiais chromatografiniais metodais, todėl jis buvo plačiai naudojamas. .

 

Inkliuzinio kūno baltymų perlankstymas:

Ištirpęs rekombinantinis baltymas turi būti tinkamai sulankstytas, kad susidarytų funkcinis baltymas. Renatūravimo būdai apima baltymo tirpalo praskiedimą iki beveik neutralaus, denatūruojančios medžiagos pašalinimą, renatūravimą kolonėlėje ir gelio filtravimo chromatografiją. Tarp jų baltymų tirpalo skiedimas iki beveik neutralaus ir denatūranto pašalinimas yra įprastas klasikinis renatūravimo būdas, ypač praskiedimo renatūravimo metodas turi didžiausią panaudojimo koeficientą.

Denatūranto pašalinimas:

Dializė: Privalumas yra tai, kad tūris nedidėja, o denatūranto pašalinimo greitis kontroliuojamas palaipsniui mažinant išorinio pralaidžio skysčio koncentraciją, tačiau tai trunka ilgai ir lengvai susidaro neaktyvūs baltymų agregatai, kurie netinka didelio masto operacija ir negali būti taikomas gamybos mastui.

Ultrafiltravimas (TFF): lengvai valdomas dializės greitis, nesvarbu, ar tai būtų atliekami tyrimai ir plėtra, bandomasis bandymas ar gamyba, gali pašalinti denatūrantus (skysčio pasikeitimas + koncentracija) ultrafiltruojant (TFF).

 

Inkliuzinio kūno baltymų valymas:

Baltymų gryninimo po renatūravimo metodai yra panašūs į tirpių baltymų gryninimo metodus, būtent jonų mainų chromatografija, gelio filtravimo chromatografija, afininė chromatografija, nusodinimas amonio sulfatu ir kt.

Inkliuziniai kūnai neturi biologinio aktyvumo, nereikia jaudintis dėl baltymų aktyvumo praradimo, o dideli ekspresijos kiekiai nesukels ląstelių mirties ir padidins atsparumą proteazių atakai. Tuščiaviduris pluoštas gali būti lanksčiai naudojamas tolesniame inkliuzinių kūnų valymo procese. Inkliuzinio kūno plovimo etape puikus našumas, palyginti su išcentriniu plovimu, devynerių metų amžiaus mikrofiltravimo tuščiavidurio pluošto naudojimas tangentinio srauto filtravimo plovimui gali labai sutrumpinti proceso laiką, o bendras atkūrimo greitis gali siekti daugiau nei 90%. „Jiuling“ tuščiaviduris pluoštas taip pat gali būti naudojamas inkliuzinių kūnų baltymų renatūravimo etape. Pašarinio skysčio, filtruoto mikrofiltravimo tuščiavidurio pluošto, drumstumas bus žymiai sumažintas, o baltymų atkūrimo greitis bus didelis; Naudojant ultrafiltracinį tuščiavidurį pluoštą galima ne tik pašalinti denatūrantus, bet ir sutrumpinti chromatografinio mėginio pakrovimo laiką, kad sutaupytumėte laiko, sumažintumėte užpildo tūrį ir sumažintumėte gamybos sąnaudas. Mikrofiltravimo / ultrafiltravimo tuščiavidurio pluošto regeneravimo greitis skiriasi priklausomai nuo skirtingų medžiagų, o bendras regeneravimo greitis gali siekti 90-95%.

„Guidling Technology“ kviečia jus prašyti bandymų rinkinių susijusioms apžvalgoms.

 

Apie Guidlingą

„Guidling Technology“ yra nacionalinė aukštųjų technologijų įmonė, daugiausia dėmesio skirianti biofarmacijai, ląstelių kultūrai, biomedicinos valymui ir koncentracijai, diagnostikai ir pramoniniams skysčiams. Sėkmingai sukūrėme išcentrinius filtrų įrenginius, ultrafiltravimo ir mikrofiltravimo kasetes, virusų filtrą, TFF sistemą, giluminį filtrą, tuščiavidurį pluoštą ir kt. Kurie visiškai atitinka biofarmacijos, ląstelių kultūros ir tt taikymo scenarijus. Mūsų membranos ir membraniniai filtrai yra plačiai naudojami koncentruojant, ekstrahuojant ir atskiriant išankstinį filtravimą, mikrofiltravimą, ultrafiltravimą ir nanofiltravimą. Mūsų daugybė produktų linijų, nuo mažo vienkartinio laboratorinio filtravimo iki gamybos filtravimo sistemų, sterilumo tyrimų, fermentacijos, ląstelių kultūros ir kt., atitinka bandymų ir gamybos poreikius. Guidling Technology laukia bendradarbiavimo su jumis!