Santrauka:

Šiame straipsnyje apžvelgiami du pagrindiniai veiksniai, į kuriuos reikia atsižvelgti į baltymų valymo strategijas: pasroviui taikymo reikalavimus ir pačių baltymų biologines savybes. Straipsnyje pabrėžiama, kad aukštos kokybės baltymų gryninimas yra eksperimentinių duomenų patikimumo ir pakartojamumo pagrindas, ypač gaminant rekombinantinius baltymus. Skirtingi taikymo scenarijai turi specifinius baltymų grynumo, aktyvumo ar endotoksino kiekio reikalavimus, o baltymų charakteristikos gali smarkiai paveikti valymo strategijas. Remiantis konkrečiais atvejais, straipsnis iliustruoja, kad unikalūs baltymai turėtų priimti pritaikytas valymo schemas. Galiausiai buvo pasiūlytas sisteminis baltymų gamybos procesas (1 paveikslas), pabrėžiant viso proceso kokybės kontrolę, pradedant raiškos sistemų pasirinkimu, konstrukcijos konstrukcija, valymo optimizavimu, ir rekomenduojant įvertinti baltymų homogeniškumą ir funkcionalumą naudojant biofizinius metodus (tokius kaip SEC-MAL, DSF ir kt.). Šiuo straipsniu siekiama pateikti praktines gaires tyrėjams, padėti jiems suformuluoti efektyvias ir pakartojamas valymo strategijas, pagrįstas tikslinių baltymų charakteristikomis ir taikymo reikalavimais, taip padidinant mokslinių tyrimų kokybę ir efektyvumą.

 

1 paveikslas. Baltymų gamybos proceso schema

 

Didelės paklausos baltymų gamyba - problemos identifikavimo pavyzdžiai, švelninimo strategijos projektavimas ir atitinkamas išvestis

 

1.nukleino rūgšties prisijungimas prie baltymų:

Valant nukleorūgštį surišančius baltymus, norint pašalinti nukleorūgšties užterštumą, reikia kelių žingsnių. Lizės metu reikia pridėti nukleazes (tokias kaip SM nukleazės (Benzonazės®) arba DNaze ar RNazės), tačiau surištų nukleorūgščių negalima visiškai pašalinti. Pakeiskite nukleorūgščių pašalinimo žingsnius, tokius kaip PEI ar streptomicino sulfato krituliai, heparino gryninimas ar jonų mainų chromatografija. Nukleorūgščių buvimas buvo stebimas A26 0 nm\/a28 0 nm santykiu per visą gryninimo procesą. Jei santykis buvo mažesnis nei 0,6, tai parodė, kad baltymų grynumas buvo palyginti didelis, o nukleorūgšties užteršimas buvo minimalus. Baltymams, turintiems stipriai surištų nukleorūgščių, jie gali būti laikinai denatūruoti (pvz., Gydomi karbamidu), o po to renačiuoti. Pagrindiniai punktai: naudokite aukštos kokybės reagentus, šviežius buferius ir švarias kolonėles (prieš naudojimą valykite su 0,5 m NaOH).

 

2. Pelės feritino sunkioji grandinė:

Išgryninto pelės feritino sunkiosios grandinės (MFTH1) baltymo gamybos tikslas yra didelės skiriamosios gebos vienos dalelės krioelektroninės mikroskopijos (krio-EM). Escherichia coli ekspresijos vektorius, užkoduotas nepaženklintas MFTH1, buvo ultragarsiškai sutrikdytas, nepridedant jokių nukleazės. Po kaitinimo esant 7 0 laipsniui, jis patyrė amonio sulfato kritulius, dializės ir dydžio pašalinimo chromatografijos etapus. Gautas mėginys parodė, kad krioelektronų mikroskopijos vaizduose (2A paveikslas) yra didelis kiekis teršalų, kurie buvo visiškai netinkami jo naudojimui. Optimizuokite veiksmus. Ląstelių lizės proceso metu pridėkite SM nukleazės ir dializės proceso po amonio sulfato nusodinimo, tada pridėkite anijonų mainų chromatografijos žingsnį, kad sumažintumėte A26 0 nm\/a280NM santykį nuo 1,4 iki 0,8. Po dydžio pašalinimo chromatografijos galutinio MFTH1 mėginio A260NM\/A280NM santykis buvo 0,56. SDS-PAGE ir krioelektronų mikroskopijos vaizdai (2B paveikslas) parodė, kad baltymas buvo labai grynas, tai rodo, kad teršalai buvo veiksmingai pašalinti.

2 pav. Pelės feritino sunkioji grandinė

 

 

 

3. Chimerinio baltymo žmogaus DSRBEC (DSRBD-EGF-Chimera):

DSRBEC susidaro susiliejus su dvigubai sruoginiu RNR rišančiu domenu (DSRBD) žmogaus baltymo kinaze R ir žmogaus epidermio augimo faktoriumi (HEGF). Kai DSRBD yra ekspresuojamas Escherichia coli, tai rodo ypač aukštą DSRNR surišimo gebėjimą. Po ląstelių lizės užteršiama RNR trukdys rekombinantinių baltymų surišimui prie fiksuoto metalo jonų afiniteto chromatografijos (IMAC) stulpelio. Įprastiniai metodai, tokie kaip PEI ar streptomicino sulfato krituliai, RNazės apdorojimas ar didelio druskos buferiniai tirpalai, negali pašalinti RNR. Ląstelių lizė buvo atlikta naudojant buferį, kuriame yra 4 m karbamidas. Supernatantas buvo įkeltas į „iMac“ stulpelį, o 4M iki 0 m karbamido buvo lėtai naudojamas per naktį (kolonėlės renatūracija). Renatavimo buferis buvo pridėtas su imidazolu ir išplaunamas iš IMAC kolonėlės. Galutinis patobulinimas buvo atliktas naudojant „Superdex 75“ gelio filtravimą, kad būtų gautas funkciškai aktyvusis DSRBEC.

 

4. Baltymai, sujungti su dvivalenčiais katijonais ar kitais kofaktoriais:

Baltymams, kurie sąveikauja su dvivalenčiais katijonais, tokiais kaip Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ ar kiti kofaktoriai, išraiškos metu labai svarbu pridėti specifinius dvivalenčius katijonus (ar kitus kofaktorius). Valymo proceso metu taip pat reikia nedidelio tų pačių dvivalenčių katijonų (ar kitų kofaktorių). Tačiau reikia išvengti bet kokių chelacinių agentų (pvz., EDTA, EGTA) ir chelatingo redukcinių agentų (pvz., DTT ar DTE) naudojimo. Kalbant apie baltymus, susijusius su dvivalenčiais katijonais, proteazės inhibitorių mišinys be chelacinių agentų turi būti naudojamas patvirtinti faktinį dialentinių katijonų (ar kitų kofaktorių) buvimą išgrynintuose baltymuose spektroskopiniais metodais (tokiais kaip atominės absorbcijos spektrofotometrija).

 

5. Rekombinantinis ferridoksinas (RFD), kuriame yra vienas [2FE ± 2S] klasteris iš termofilinių cianobakterijų mastigocladus laminosus

Ferridoksinas yra tirpus geležies sieros baltymas, kuris dalyvauja elektronų perdavimo reakcijose. Augalų tipo ferrorredoksinas turi vieną [2FE ± 2S] klasterį kaip I fotosistemos elektronų akceptorių. Escherichia coli BL21 (DE3) padermė išreiškė rekombinantinį RFD baltymą TB terpėje, kurioje yra 10 mm FECL3 ir antibiotikai. „IMAC“ fiksavimo kolonėlės eliuavimas buvo atliktas naudojant buferį, kuriame yra 10 mm histidino, kad būtų išvengta imidazolo ir užkirsti kelią [2FE ± 2S] klasterio sunaikinimui. Anijonų mainų ir dydžio išskyrimo chromatografija buvo naudojama tolesniam gryninimui ir koncentracijai iki 12 mg\/ml kristalizacijos patikrinimui. Palyginti su rekombinantine ferrorroredoksino gamyba, natūralus ferrorrorredoksinas, išgrynintas iš mėlynai žalių dumblių Mastigocladus laminosus, kristalizacijos metu pasiekė didesnę skiriamąją gebą.

 

6. Baltymai, naudojami kaip antigenai

Baltymai dažnai naudojami kaip antigenai, kad būtų galima atkurti konkrečius taikinius. Pirmas dalykas, į kurį reikia atsižvelgti, yra tai, ar baltymas naudojamas imuniteto in vivo, norint gauti įprastą monokloninį ar polikloninį IgG, ar programas, susijusias su kupranugario IgG ar in vitro atrankos procesais.

 

6.1 Antigenai, naudojami įprastiniam antikūnų gamybai

Kai antigenai naudojami monokloninių IgG antikūnų gamybai gaminti, teisingas antigeno sulankstymas paprastai nėra būtinas, nes dauguma monokloninių antikūnų atpažįsta linijinius epitopus, kuriems antigeno struktūra daro didelę įtaką ir netgi denatūruoti antigenai (tokie kaip įtraukimo kūno baltymai). Tačiau grynumas turi būti griežtai kontroliuojamas, kad būtų išvengta stiprių imunogeninių teršalų, trukdančių imuniniam atsakui ir sukeldami ne tikslinių antikūnų dominavimą.

 

6.2 Konjuguotos bibliotekos patikrinimas

Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas natūralios antigeno konformacijos palaikymui perdirbant nanobodžių biblioteką, gautą imunizuojant kupranugarius. Skirtingai nuo įprastų antikūnų, kupranugarių antikūnai (ypač nanodaleliai) linkę atpažinti struktūrinius epitopus, kurie yra susiję su jų unikalia išgaubta papildoma vietos struktūra. Panašiai, tikrinant dideles sintetines ar natūralias antikūnų bibliotekas in vitro, antigenas turi išlaikyti struktūrą, kuri visiškai atitiktų tikslinį taikymą. Kadangi pats atrankos procesas nėra šališkas, jei antigenas turi klaidingą sulankstymą, agregaciją ar konformacinį heterogeniškumą, gali būti tikrinami daugybė konjugatų, nukreiptų į natūralius epitopus.

 

 

 

7. Baltymai, turintys tarpmolekulinius arba intramolekulinius disulfidinius ryšius arba laisvą cisteiną

Disulfido ryšiai yra labai svarbūs norint stabilizuoti natūralią baltymų struktūrą. Valymo proceso metu, valydami baltymus, kuriuose yra tarpmolekulinių ar intramolekulinių disulfidinių ryšių, būtina išvengti redukuojančių agentų, kad būtų išvengta baltymų konformacinių pokyčių, taip pakeisdami jų funkcijas. Baltymams, kuriuose yra laisvo cisteino, redukuojantys agentai yra būtini visuose gryninimo proceso etapuose, ypač laikant laikant, kad būtų išvengta dirbtinių disulfidinių jungčių susidarymo. Dažniausiai naudojami redukuojantys agentai yra ditiotreitolis (DTT), -mercaptoetanolis (-Me) ir Tris ({2- karboksietil) fosfino hidrochloridas (TCEP). IMAC dervoms, kurios nesuderinamos su DTT arba TCEP, rekomenduojama naudoti -Me ir pakeisti juos kitais redukuojančiais agentais vėlesniais etapais.

 

8. Rekombinantinis antikūnų fragmentas

Nors rekombinantinių antikūnų fragmentų struktūra (pvz., Nanobodijos) yra paprastesnė nei IgG, jų funkcija priklauso nuo teisingo disulfidinių jungčių susidarymo. Bakterijų ekspresijos sistemose, net priėmus optimizavimo strategijas, vis dar gali atsirasti neteisingai sulankstyti arba iš dalies sulankstyti produktai, kurie egzistuoja tiek tirpioje dalyje, tiek įtraukimo kūne. Labiau paslėpta, kad net teisingai sulankstyti antikūnų fragmentai gali sudaryti tirpius agregatus (koloidų agregaciją) per hidrofobines plokšteles ant paviršiaus. Tokius agregatus sunku nustatyti atliekant įprastus funkcinius bandymus (pvz., ELISA), nes daugiavalentis surišimas gali užmaskuoti monomero afiniteto sumažėjimą, tačiau jų buvimas gali rimtai paveikti programas, kurios priklauso nuo mažos molekulės dydžio (pvz., Super-raiškos mikroskopija). Todėl norint įvertinti imties kokybę, nepakanka pasikliauti vien SDS-PAGE. Biofiziniai metodai, tokie kaip gelio filtravimas (3 paveikslas), turi būti naudojami norint atskirti monomerus (pagrindines smailes) nuo agregatų (pašalinimo tūrio smailės). Pagrindiniai kontrolės taškai yra: Redokso aplinkos optimizavimas išraiškos metu, siekiant skatinti disulfidinių jungčių formavimąsi, ir saugojimo sąlygų optimizavimas po gryninimo, kad būtų išvengta agregacijos. Šios priemonės yra labai svarbios užtikrinant antikūnų fragmentų monodispersiškumą ir funkcijas.

3 paveikslas. Gelio filtravimas tirpių nanobodijų agregatų atskyrimas

 

9. Tirpūs limfocitų receptorių fragmentai LLT1

Rekombinantinė nuo jungties priklausomų baltymų (tokių kaip limfocitų receptorių LLT1) išraiška dažnai susiduria su sulankstomais sunkumais. Laukinio tipo LLT1 gelio filtravimas parodė agregacijos smailes ir dimerų smailes (4A paveikslas), tačiau masės spektrometrija atskleidė klaidingą sulankstymą, kurį sukėlė neporinis dimere (4B paveikslas). Šiuo tikslu buvo suprojektuoti du mutantai: vienas pašalino probleminį cisteiną, todėl staiga sumažėjo derlius (4A paveikslas); Įvedus neocisteiną, rekonstruoti suderintą disulfido ryšį, mutantas ne tik turėjo didelį išeigą ir gerą stabilumą, bet ir galėjo kristalizuoti (4C paveikslas), o 3D struktūra patvirtino, kad mutantas sudarė teisingą disulfido ryšį ir palaikė natūralų sulankstymą. Šis atvejis parodo, kad racionaliai projektuojant konforminius disulfidinius ryšius, kartu su gelio filtravimo ir masės spektrometrijos analize, galima efektyviai išspręsti rekombinantinių baltymų sulankstymo problemą ir galima gauti funkcinius baltymus su stabiliomis struktūromis ir dideliu derliumi.

4 paveikslas. Disulfido ryšių rekonstrukcija pagerina tirpaus LLT1 sulankstymą ir išeigą

 

 

 

10. Lengvai sujungti baltymai

Rekombinantinių baltymų gryninimas dažnai susiduria su agregacijos problema, o jo susidarymas seka „branduolio augimo“ mechanizmą-pirmiausia susidaro nedidelis kiekis tirpių agregatų, o paskui sukelia didelio masto netirpų agregaciją. To address this challenge, multi-level strategies need to be adopted: At the expression stage, this can be achieved by optimizing the strain, reducing the culture temperature, using modified culture media or different solubilizing fusion proteins, and replacing expression systems (insect\/mammalian cells), etc. During the purification stage, rapid operation (in a 4 degree C environment) is required to avoid excessive protein concentration, and a "rapid purification strategy" (such as direct connection of „IMac to sec“) turėtų būti priimtas, kad būtų galima nedelsiant pašalinti agregatinius branduolius. Apskritai, kai tikrinami buferiniai tirpalai, reikia atsižvelgti į tokius veiksnius kaip komponentų sudėtis, pH vertė, atsiribojanti agentas ar tirpalas (5 paveikslas). Nustatytas tiksliai optimizavus stačiakampį aptikimą (pvz., SEC, CD, LS, DSF ir temperatūros poslinkį, atsižvelgiant į fluorescencinę šilumą ir kt.), Buvo nustatyta baltymų kokybė ir tinkamiausias buferio tirpalas.

5 paveikslas. Baltymų agregacijos mažinimo strategijos

 

11. Žmogaus CLK1 kinazės kristalizavimas (kaip gauti atkuriamas partijas)

Norint gauti homogenišką nefosforilintą CLK1 kinazę kristalizacijos tyrimams, buvo priimta daugiakampė bendradarbiavimo schema. Pirmiausia, jis buvo kartu su λ -fosfataze Escherichia coli, siekiant pašalinti autofosforilinimo heterogeniškumą. Nors derlius buvo sumažintas, buvo užtikrintas visiškas defosforilinimas. Po „IMAC“ užfiksavimo, „Elium“ buvo papildytas stabilizatoriais (50 mm argininu, 50 mm glutamo rūgštimi ir 10 mm DTT), kad būtų išvengta agregacijos, sukoncentruota, o jo žyma buvo pašalinta virškinant TEV. Tada teisingas oligomeras buvo atskirtas SEC (turint 5% glicerolio ir -Me). Galutinis esminis anijonų mainų žingsnis išskiria kristalinį (nefosforilintą) ir ne kristalinę (iš dalies fosforilintą) CLK1 grupes. Ypač verta paminėti, kad ląstelių lizės būdas daro didelę įtaką baltymų stabilumui-aukšto slėgio ir aukštos temperatūros metodas lemia negrįžtamą CLK1 agregaciją, pabrėžiant lengvą gydymo svarbą kinazės paruošimui.

 

 

 

12. Gaminkite galektiną -1

Norėdami paruošti funkcinį galektiną -1 ligandų surišimo tyrimams, buvo palygintas keturių konstrukcijų (nepaženklintų ir žymių laukinio tipo galektino -1) ekspresijos ir valymo strategijos, buvo lyginami nepaženklintos ir jo žymimos cisteino be mutanto galektino -1). Pagrindiniai duomenys rodo, kad laktozės afiniteto chromatografijos gryninimas gali efektyviai patikrinti teisingai sulankstytus baltymus, tačiau jį reikia derinti su kruopščia dialize (HEPES buferiu), kad būtų galima visiškai pašalinti laktozę iš surišimo vietos ir atkurti CRD aktyvumą. Laukinio tipo galektinas -1 yra linkęs į oksidaciją ir inaktyvaciją, o jo stabilumas išlieka ribotas net esant redukuojantiems agentams (6 paveikslas). Tačiau mutantas be cisteino žymiai padidina ilgalaikį stabilumą, išlaikant panašų agliutinacijos aktyvumą ir šiluminį stabilumą (patikrintą NANODSF, ITC ir kt.), Pašalinant priklausomybę nuo disulfido ryšių.

6 paveikslas. Rekombinantinio galektino -1 hidrodinaminis apibūdinimas atskleidžia jo nestabilumą

 

13. Endotoksino pašalinimas

Endotoksinų pašalinimo metodas yra pagrįstas afiniteto chromatografija, įskaitant teigiamai įkrautą chromatografiją (anijonų mainus), polikacinių ligandų (tokių kaip poli-L-lizinas (PLL), imobilizuoto poliamino (polimyxin B) ir naudojimo ir paviršiaus aktyviosios medžiagos tritono x -114 pridėjimas. Valymo proceso metu atkreipkite dėmesį į buferinio tirpalo paruošimą be LPS be vandens ir naudokite naujus stulpelius ar stulpelius, kurie buvo naudojami tik kitose LPS gryninimuose. Endotoksino užterštumui chromatografinę siurblio\/skysčio sistemą galima inkubuojama per naktį 0. 5m NaOH arba 4 valandas per 1. 0 m NaOH. Galutinis LPS kiekis mėginyje buvo įvertintas naudojant Limulus amebocitų lizato reagentą (LAL), ir buvo patikrinta, ar jis buvo mažesnis už ribą, reikalingą konkrečiam taikymui.

 

14. Baltymų kompleksas

Baltymų kompleksų ekspresiją ir valymą reikia optimizuoti atsižvelgiant į konkrečias sąlygas. Iššūkiai apima subvienetų nestabilumą ar netinkamą sulankstymą. Kiekvienas subvienetas gali būti išreikštas savarankiškai ir surinktas in vitro arba kartu išreikštu, kad sudarytų funkcinius baltymų kompleksus. Statybos dizainas turėtų būti kruopščiai įvestas su valymo ar aptikimo etiketėmis, kad būtų išvengta trukdžių surinkimo, ypač kai sudėtinga informacija yra ribota ir reikalinga daugybinė optimizacija. Valymo proceso metu reikia įvertinti komplekso vientisumą ir stabilumą. Metodai apima SDS-PAGE (subvienetų aptikimą), SEC (homogeniškumas), SEC-MAL (molinės masės analizė), masės fotometrija arba natūralios masės spektrometrija (masės patikrinimas). Reikėtų pažymėti, kad kompleksas gali atsiriboti nuo mažos koncentracijos. Šiuo metu reikia optimizuoti chromatografinį metodą arba buferį (pvz., Dėl šiluminio dreifo ar DSF atrankos sąlygų). Be to, sumažinus valymo veiksmus, galima užkirsti kelią silpnų sąveikos subvienetų praradimui ir subalansuoti valymo efektyvumą bei komplekso vientisumą.

 

 

 

15. Antigeno ir antikūnų kompleksų gryninimas

Antikūnų ir antigeno kompleksai yra tipiniai baltymų kompleksų pavyzdžiai. Jų bendras kristalizavimas gali atskleisti įrišimo modelius ir nukreipti antikūnų inžinerijos optimizavimą. Tradiciniams metodams reikalingas atskiras antigenų ir antikūnų valymas, tada juos maišant. Tačiau naujausi tyrimai parodė, kad bendro išraiškos ir bendro rinkimo strategijos yra efektyvesnės. Norint gauti kompleksą, reikia tik vieno gryninimo, o tuo pačiu metu nestabilius antigenus galima stabilizuoti per antikūnus, ir net etiketę be etikečių galima pasiekti. Esant šioje konkrečioje situacijoje, SDS-PAGE ir GEL filtravimo (SEC) paprastai pakanka, kad būtų galima įvertinti komplekso grynumą ir kokybę.

 

Santrauka

Baltymų gryninimas yra pagrindinė mokslinių tyrimų technologija. Akademinio masto baltymų gamyba paprastai laikosi standartinių strategijų ir gali gaminti miligramų lygio didelio grynumo, tirpių baltymų, kurie yra plačiai naudojami struktūrinėje biologijoje, biochemijoje ir funkciniuose tyrimuose. Tačiau specialūs paskesnių taikymo reikalavimai (pvz., Nereikia jokio endotoksino eksperimentuose su gyvūnais ir nukleazės užterštumas atliekant nukleorūgščių tyrimus) arba būdingi baltymų savybės (pvz., Lengvas agregavimas, turintys disulfidinius ryšius ar aukštą branduolio rūgšties afinitetą), dažnai reikalingi pritaikyti sprendimai. Ši apžvalga, reaguodama į šias ypatingas aplinkybes, siūlo patobulintas strategijas, pradedant raiškos sistemų pasirinkimu, konstrukcijų projektavimu (etikečių ir domenų ribų optimizavimu) iki valymo proceso ir įvedant kokybės kontrolę (pvz., SEC, SDS-PAGE, veiklos nustatymą ir kt.) Pagrindiniais etapais. Kai kurioms programoms taip pat reikalinga papildoma analizė (pvz., Endotoksinų aptikimas ir nukleorūgščių liekanų nustatymas), panašiai kaip „kokybės užtikrinimo“ (QA) koncepcija biofarmacijos pramonėje, tai yra, kad būtų išvengta defektų sisteminiuose procesuose. Formuliuojant kokybės kontrolės gaires ir paaiškinant konkrečius baltymų reagentų, naudojamų moksliniuose tyrimuose, standartus, tikslas yra nustatyti griežtesnes baltymų valymo normas akademinėms laboratorijoms, padidinti eksperimentinių duomenų patikimumą ir pakartojamumą ir panaikinti atotrūkį tarp pagrindinių tyrimų ir pramonės standartų.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5