Viruso pavidalo dalelių vakcina ir jos paskesnis valymo procesas

Virusas panašios dalelių (VLP) vakcina yra vakcinos technologija, pagrįsta viruso struktūra, tačiau joje nėra virusinių genetinių medžiagų. Jie stimuliuoja stiprų imuninį atsaką, imituodami natūralių virusų morfologiją ir paviršiaus antigenus, ir suteikia didesnį saugumą dėl nesugebėjimo atkartoti. VLP vakcinos yra geresnė alternatyva tradicinėms vakcinoms (tiesiogiai susilpnintos ir inaktyvintos). VLP vakcina negali pakartoti organizme, todėl ji tinka visiems, įskaitant nėščias moteris ar tas, kurios turi pažeistą imuninę sistemą. Be to, Capsid baltymai (įskaitant kitus struktūrinius baltymus) iš virusų su segmentiniais genomais, tokiais kaip gripo virusai, Afrikos žirgų ligos virusai ir „Bluetongue“ virusai, taip pat gali būti naudojami VLP vakcinoms kurti, nesijaudinant dėl ​​genetinės rekombinacijos problemų, tokių kaip susilpnėjusios gyvos vakcinos. Antra, VLP gali imituoti realių virusų struktūrą, skirtingai nei inaktyvuotos vakcinos, kurių struktūriniai baltymai gali būti modifikuoti inaktyvacijos metu, todėl atsiranda imunogeninis sutrikimas.

 

Fig. 1. VLP ir chimerinių VLP formavimo mechanizmas

 

VLP vakcinos ypatybės

1. Struktūra, panaši į natūralius virusus: VLP yra surinktos iš virusinių vieno ar daugiau struktūrinių baltymų (pvz., Kapsidų baltymų), o jų dydis ir forma yra panašūs į tikrus virusus.

2. Nefekcinis: nėra viruso genomo, jis negali atkartoti ar sukelti ligos.

3. Didelis imunogeniškumas: Granulinė struktūra gali būti veiksminga imuninė sistema ir suaktyvinti B ląstelių ir T ląstelių reakcijas. Gali sukelti neutralizuojančius antikūnus ir ląstelių imunitetą (pvz., ŽIV, ŽPV vakcinos).

4. Aukštas saugumas: tinka žmonėms, turintiems mažai imuninės funkcijos (pvz., Hepatito B VLP vakcina).

 

Fig. 2. Galimos VLP vakcinos

 

VLP vakcinų gamybos sistema

VLP gali būti gaminami naudojant įvairias išraiškos sistemas, įprastos platformos apima:

 

1. Vabzdžių ląstelių-baculoviruso sistema:

Privalumai: didelis išeiga, maža kaina, tinkama sudėtingam baltymų surinkimui.

Taikymas: ŽPV vakcina, Ebolos vakcina.

 

2. Žinduolių ląstelės (pvz., HEK293 ląstelės):

Privalumai: Post-transliacijos modifikacijos yra artimesnės žmonėms ir tinkamos apvalkalams VLP (tokioms kaip gripo vakcinos).

 

3. Mielių sistemos (pvz., „Pichia Pastoris“):

Privalumai: Greita, maža kaina buvo naudojama vakcinoje „Hepatitas B“.

 

4. Augalų sistemos (pvz., Tabako chloroplastai):

Ekologija ir keičiama, kuriama (pvz., NOROVIRUIRAS VLP vakcina).

 

VLP vakcinos valymo procesas pasroviui

VLPS ekspresijos sistemų įvairovė lemia paskesnių valymo procesų inuniversalumą.

 

 

Fig. 3 Bendroji pasrovio proceso srauto diagrama

 

Derlius ir paaiškinimas:

Visų rūšių kultūrinėje terpėje, leidžiant ląstelių kultūrą, yra daugybė virusų dalelių, taip pat daugybė ląstelių audinių šiukšlių, medžiagų apykaitos produktų ir kitų priemaišų, todėl kultūrinė vidutiniškai debesuota ar pusiau užplūdama, jei koncentruojama kultūra tiesiogiai, ultrafiltravimo membrana bus blokuojama, rezultatas, kurio koncentracija negali būti užbaigta, o ultrafiltravimo membrane yra užblokuota. Todėl pirmiausia reikia paaiškinti prieš koncentraciją, kad būtų pašalintos didelės dalelės kultūrinėje terpėje, kad ji taptų permatomu ar skaidriu tirpalu, o kultūrinės terpės koncentracija gali padaryti koncentracijos procesą normalų ir užtikrinti ultrafiltracijos membranos tarnavimo laiką. Paaiškinimas prieš kultūros sprendimo koncentraciją yra pagrindinė techninė sąsaja koncentracijos procese.

 

Veiksmingam paaiškinimo procesui reikalingas didelės talpos derinys, norint pašalinti kietas daleles, didelį produkto išeigą, lengvą mastelio kaupimą ir apsaugą iki pasroviui veikiančių vienetų.

 

Metodas

Centrifugavimas: Diferencinis centrifugavimas pašalina dideles daleles.

Gilus filtravimas: naudokite daugiapakopį filtrą (pvz., 1,2 μm → 0.

Tangentinio srauto filtravimas (TFF): tinkama masinei gamybai, koncentruojasi mėginių ir pašalina mažas priemaišų daleles.

 

Tačiau jei auginimo skalė yra per didelė, centrifugavimas užtrunka ilgai, reikės daugybės giliųjų filtrų membranų, taigi eksploatacinių medžiagų kaina labai padidėja. Tuo pačiu metu didelis ląstelių kultūros tankis sumažins giliosios filtro membranos apkrovą, todėl padidės išlaidos ir per didelis produkto skiedimas.

 

Yra dviejų rūšių TFF membranos komponentai: plokščios kasetės ir tuščiavidurio pluošto. Tangentinio srauto filtravimą (TFF) lemia transmembraninio slėgio skirtumas. Medžiagos ir priemaišos, kurios yra mažesnės už membranos poras, praeina per membraną, o priemaišos, tokios kaip ląstelės su didesnėmis dalelėmis, yra įstrigusios. Membranos, naudojamos mikrofiltracijai, porų dydis yra {{0}}. 45/0,22 μm. Tuščiaviduriai pluoštas gali tiesiogiai apdoroti didelį kietą turinio skystį, pavyzdžiui, didelio tankio ląstelių kultūros terpę, jis gali pašalinti centrifugavimo ir prieš filtruojimą žingsnius, mažiau žingsnių, paprastą veikimą, membraną galima pakartotinai naudoti valant, sumažinant investicijas į įrangą ir eksploatavimo išlaidas, atsižvelgiant į modulinės automatinės gamybos reikalavimus.

 

Ultrafiltracijos koncentracija (TFF):

Tikslas: Norėdami sumažinti chromatografinio gydymo kiekį, pagerinkite chromatografinį efektyvumą ir apsaugokite chromatografinę koloną.

Apskritai ultrafiltracija (TFF) gali sutelkti daugiau nei 100 kartų VLP, o heteroproteino pašalinimo greitis gali pasiekti 99%. Tarp jų tuščiavidurio pluošto membranos filtravimo technologija turi švelnios ir mažos šlyties jėgos pranašumus, nėra lengva prijungti, lankstus eksploatavimas, ilgas tarnavimas, mažos išlaidos ir lengvas amplifikavimas, todėl rekomenduojama pasirinkti tuščiavidurį pluoštą koncentruotam ir išgrynintam VLP.

 

Kai koncentracijai ir valymui naudojamas ultrafiltracijos metodas, labai svarbu pasirinkti tinkamą membranos porų dydį, kuris lemia koncentracijos efektyvumą ir kokybę tiesiogiai. Viena vertus, būtina pasirinkti membranos angą, kad būtų galima efektyviai sulaikyti tikslines molekules, kad būtų užtikrintas išeiga, o kita vertus, turėtų būti visiškai atsižvelgiama į heteroproteinų pašalinimo efektą ir apdorojimo greitį. Todėl geriausias principas yra pasirinkti membraną su didžiausiu porų dydžiu, kuris gali sugauti tikslinę molekulę, ir pabandyti pasirinkti filtro membraną su vienodo porų dydžio pasiskirstymu.

 

Pirminis apsivalymas:

1. Kritulių metodas

Polietilenglikolio (PEG) krituliai: Selektyviai nusodinant VLP, reikia optimizuotos PEG koncentracijos ir druskos koncentracijos, kad būtų subalansuotas derlius ir grynumas.

 

2. Chromatografija

Afiniteto chromatografija:

Heparino afinitetas: naudojant paviršiaus neigiamo paviršiaus VLPS savybes (pvz., ŽPV VLP).

Antikūnų jungimo chromatografija: didelis specifiškumas, bet brangus.

Jonų mainų chromatografija (IEX): Pasirinkite anijonų mainus (pvz., Q stulpelį) arba katijonų mainus (pvz., SP stulpelį), atsižvelgiant į VLP paviršiaus krūvio charakteristikas ir optimizuokite pH ir druskos gradientą, kad išvengtumėte dalelių agregacijos.

Hidrofobinė sąveikos chromatografija (HIC): Remiantis VLP paviršiaus hidrofobiškumu, tinkamu kai kuriems neinkapsuotoms VLP.

 

Puikus apsivalymas:

Molekulinės atskirties chromatografija (SEC, GEL filtravimas):

Liekamųjų baltymų, nukleorūgščių ar užpildų likutinių šeimininkų pašalinimo, lydimas buferio pakeitimo. Didelė skiriamoji geba, bet maža srautas, dažnai naudojamas kaip galutinis tobulinimo žingsnis.

 

Kelių režimų chromatografija:

Pavyzdžiui, „Capto Core“ serijos dervos kartu su jonų mainų ir molekulinio sieto efektu gali pašalinti įvairias priemaišas per vieną žingsnį.

 

Viruso inaktyvacija/nukleorūgšties pašalinimas (jei reikia):

Nukleazės apdorojimas: pavyzdžiui, benzonazės skaidymo šeimininko DNR/RNR.

UF/DF: TFF sistemos koordinavimas, siekiant pašalinti mažus nukleorūgščių ir fermentų fragmentus.

 

Koncentracija ir paruošimas:

Tangentinio srauto filtravimas (TFF):

Susitelkite į tikslinius titrus, išstumdami buferius (pvz., PBS ar kompozicijos buferius).

 

Sterilus filtravimas:

0. 22 μm membranos filtravimas užtikrina sterilumą.

 

Tipiškas atvejis

Toliau pateikiami tipiškų VLP vakcinų valymo procesai.

 

 

Apie gavimą

„Guidling Technology“ yra į gamybą orientuota ir aukštųjų technologijų įmonė, orientuota į „Biopharmaceuticals“ paaiškinimą, atskyrimą ir valymą. Produktai yra plačiai naudojami MAb, vakcinos, diagnozės, kraujo produktų, serumo, endotoksino ir kitų biologinių produktų filtravimo procese; Guidlingo technologija turi „kasetės filtro ir tangentinio srauto filtravimo įtaisą“, „tuščiavidurio pluošto membraną“, „viruso filtrą“, „gilią membraną“, „sterilizacijos filtrą“, „scentrifugalinį filtro įtaisus “ir kitus produktus, ir turi daugybę produktų linijų, nuo mažų disponuojamų laboratorijų filtravimo filtravimo sistemą, patenkinti testavimo ir gamybos poreikius. „Guidling Technology“ tikisi bendradarbiauti su jumis!