Kraujo produktų inaktyvavimo ir virusų šalinimo technologija

Kraujo produktai yra „plazmos baltymų komponentai arba kraujo ląstelių komponentai, tokie kaip žmogaus kraujo albuminas, žmogaus imunoglobulinas, žmogaus krešėjimo faktorius (natūralus arba rekombinantinis) raudonųjų kraujo kūnelių koncentratas ir kt., atskirti nuo sveiko žmogaus plazmos arba konkrečiai imuninės žmogaus plazmos, išgryninti arba pagaminti naudojant rekombinantinės DNR technologiją, diagnozei, gydymui arba pasyviajai imunoprofilaktikai“. Kraujo produktai atlieka svarbų vaidmenį teikiant skubią medicinos pagalbą, gelbėjant nuo karo sužeidimų ir kai kurių specifinių ligų prevencijai bei gydymui.

 

Reguliavimo fonas

Saugumo užtikrinimo praktika turi užtikrinti, kad galutinis vaistas būtų saugus reguliavimo institucijoms ir galiausiai pacientams bei visuomenei. Dešimtajame dešimtmetyje Tarptautinė koordinavimo konferencija (1998 m. ICH) paskelbė „Q5A: Žmogaus arba gyvūno kilmės ląstelių linijų biotechnologinių produktų virusinės saugos įvertinimas“ (Q5A: Viral Safety Assessment), nustatantį pasaulinį virusinės saugos standartą.

ICH Q5A aprašo daugiapakopę testavimo ir patvirtinimo patvirtinimo schemą, kad būtų pasiektas šis tikslas. Bandymų programoje pagrindinis dėmesys skiriamas ląstelių bankui, žaliavų ir bioreaktorių surinkimui, papildyta produkto rizikos analize. Be bandymų, ICH Q5A reikalauja, kad nukenksminimas pasroviui būtų įvertintas kaip saugi priemonė, kai prieš srovę neaptinkama jokių teršalų. Klirenso patikra užtikrina, kad jei koks nors virusas išvengia testavimo režimo, jis gali būti pašalintas ir (arba) inaktyvuotas prieš patenkant į galutinį vaisto produktą.

 

Bendros virusų apsaugos programos fonas

Šiuolaikinėje biotechnologijų gamyboje (arba bioprocese) visoje išgrynintoje sekoje paprastai atliekamos trys ar keturios operacijos, galinčios pašalinti arba inaktyvuoti virusą. Tai apima tam tikrus chromatografijos etapus (pvz., baltymų A arba anijonų mainus), žemo pH arba ploviklių kultūrą ir virusų sulaikymo filtrus. Ne visi šie veiksmai veiksmingai pašalins arba išaktyvins visus virusus.

Pavyzdžiui, žemo pH kultūra paprastai yra neveiksminga viruso be apvalkalo inaktyvacijai, tačiau ji gerai veikia apvalkalo viruso inaktyvavimui. Tam tikromis veikimo sąlygomis anijonų mainų kolonėlė gali nepajėgti surišti ir pašalinti iš produkto srauto neutralių izoelektrinių virusų, tačiau ji veiksminga prieš rūgštinius virusus.

Tai trijų ar keturių nepriklausomų ir stačiakampių vienetinių operacijų derinys, kuris kartu užtikrina biotechnologinių produktų virusų saugumą.

 

Paprastai daroma prielaida, kad atliekant tvirtą, efektyvų ir patikimą apdorojimo veiksmą bus galima pašalinti arba inaktyvuoti daug virusų (paprastai apibrėžiama kaip 4 log10 ar daugiau, kai log redukcijos vertė arba LRV apskaičiuojama kaip log10 visos sumos. virusų skaičius įvestyje, padalytas iš bendro virusų skaičiaus išvestyje). Tačiau LRV negali būti naudojamas kaip vienas absoliutus žingsnio efektyvumo matas. Duomenys gali būti preliminarūs. Jį lengva modeliuoti, jis gana nejautrus proceso sąlygų pokyčiams ir veiksmingas prieš įvairius virusus (PSO 2004).

Virusų filtravimas yra plačiai pripažįstamas kaip toks galingas ir efektyvus proceso žingsnis ir yra pagrindinė bendros strategijos, kuria siekiama sumažinti egzogeninių ir endogeninių virusinių dalelių riziką gaminant biotechnologinius produktus, sudedamoji dalis.

Virusiniai filtrai dažnai veikia per stiprius, dydžiu pagrįstus sulaikymo mechanizmus. Remiantis šiuo galingu veikimo mechanizmu, virusų filtrai labiau nei chromatografiniai žingsniai užtikrina nuspėjamą virusų sulaikymą įvairiems virusams. Taip yra todėl, kad filtrą mažiau paveiks skirtingų virusų fizikinių ir cheminių savybių skirtumai bei viruso ir dervos sąveika, kurią reguliuoja veikimo sąlygos. Todėl viruso filtravimo etapas dažniausiai naudojamas gerai suplanuotuose rekombinantinių terapinių baltymų gryninimo procesuose (EMEA 1996), kurie taip pat yra patikimi plazmos perdirbimo pramonėje.

 

Tačiau kraujo produktai yra tarsi dviašmenis kardas, kuris ne tik gelbsti tūkstančius gyvybių, bet ir turi galimybę plisti ligas bei kelti grėsmę žmonių sveikatai. Remiantis statistika, nuo 1977 iki 1984 m. mažiausiai 30,000 kraujo gavėjų Jungtinėse Amerikos Valstijose gavo kraujo, užkrėsto AIDS virusu. 1985 m. 1 200 iš 3 hemofilija sergančių žmonių Prancūzijoje buvo užsikrėtę AIDS perpilant kraują arba kraujo produktus.

Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, 5–10 % AIDS infekcijų visame pasaulyje sukelia AIDS užkrėsto kraujo ar jo produktų perpylimas. Pirmasis AIDS atvejis Kinijoje buvo užkrėstas naudojant importuotus AIDS virusu užkrėstus kraujo produktus. Be to, buvo pranešta apie hepatito B ir C ligų perdavimą dėl kraujo ir kraujo produktų perpylimo.

 

1. Pagrindiniai kraujo produktais perduodami virusai ir jų savybės

Yra daug virusų tipų, kurie perduodami per kraują ir kraujo produktus, kaip parodyta 1 lentelėje. Tarp jų ŽIV, HBV ir HCV buvo susirūpinę šalies ir užsienio medicinos sluoksniais dėl didelio užsikrėtimo lygio ir didelės žalos.

Kadangi kraujas ir kraujo produktai gali platinti virusus, tai labai paveikė jo taikymą ligų prevencijai ir gydymui. Todėl gaminant kraujo produktus, siekiant užtikrinti kraujo produktų saugumą, būtina įtraukti virusų inaktyvavimo ir pašalinimo procesus.

2. Pagrindiniai viruso inaktyvavimo ir pašalinimo būdai

Siekiant užtikrinti kraujo produktų saugumą, be kraujo donorų atrankos, imunizacijos, jei įmanoma, ir griežto surinkto kraujo tyrimo bei kitų priemonių, kraujo produktų inaktyvavimas ir virusų gydymo pašalinimas yra svarbi grandis, užtikrinanti kraujo perpylimo saugumas. Toliau išsamiai aprašyti keli dažniausiai naudojami ir veiksmingi virusų inaktyvavimo ir pašalinimo būdai.

 

I. Viruso inaktyvavimo metodai

1. Pastero metodas

Šio metodo teorinis pagrindas yra tas, kad viruso struktūros sunaikinimo greitis yra daug didesnis nei baltymų struktūros, pasirinkus temperatūrą ir veikimo laiką. Beveik 50 metų klinikinio naudojimo rezultatai ir naujausi eksperimentai su gyvūnais patvirtino, kad albuminas tirpale po 60 laipsnių 10 valandų kaitinimo, tai yra Pasteur dezinfekcijos, gali ne tik inaktyvuoti HBV, bet ir HCV bei ŽIV, todėl albuminas yra patikimiausias. kraujo produktas yra saugus nuo virusų.

Pastaruoju metu Pasteur procesas buvo išplėstas iki IVIG, FVI, FIX, fibrinogeno ir kitų produktų gamybos. Bridonnccu ir kt. pridėjo šį viruso inaktyvavimo procesą prie žemos temperatūros etanolio gamybos IVIG proceso, tai yra, Pasteur metodas buvo įgyvendintas esant be stabilizatoriaus, mažo druskos ir rūgštingumo, o viruso titras sumažėjo 5 Log. Simmonds ir kt. ištyrė JK kliniškai naudojamų FVⅢ ir FIX koncentruotų preparatų perpylimo būdu perduodamą virusą (TTV) ir nustatė, kad produktų be Pasteur viruso inaktyvavimo TTV aptikimo dažnis buvo nuo 50 % iki 75 %, o teigiamo aptikimo dažnis. produktų po Pasteur inaktyvavimo buvo 0.

TTV teigiamas rodiklis buvo 27 % 84 hemofilija sergančių pacientų Jungtinėje Karalystėje, vartojusių neinaktyvintus krešėjimo faktoriaus produktus, tuo tarpu tik 1 iš 19 pacientų, vartojusių virusu inaktyvuotus krešėjimo faktoriaus produktus, buvo teigiamas, o teigiamas aptikimo rodiklis buvo 5 %. Todėl viruso inaktyvavimo procesas labai efektyviai pagerina kraujo produktų saugumą.

 

2. Organinis tirpiklis kartu su aktyviąja paviršiaus medžiaga (S/D metodas)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90 proc. Daugelis kraujo produktų, inaktyvuotų S/D metodu, buvo saugūs ir patikimi dėl ilgalaikio klinikinio taikymo, todėl jie plačiai naudojami. Tačiau šis metodas neturi inaktyvavimo prieš parvovirusą B19, HEV ir kitus nelipo dengtus virusus.

 

3. Sauso karščio inaktyvavimo būdas

Sauso karščio inaktyvavimas reiškia, kad liofilizuotas preparatas apdorojamas kaitinant, o virusas sunaikinamas sausu karščiu. Dažniausiai naudojami sauso karščio metodai yra 60 laipsniai ~80 laipsnių, 10-72 valandų šildymo metodas ir 80 laipsnių, 72 valandų apdorojimo metodas. Jau devintojo dešimtmečio pradžioje buvo naudinga FVIII liofilizuotą koncentruotą preparatą ir protrombino kompleksą kaitinti 60–80 laipsnių temperatūroje 10–72 valandas. Tačiau buvo įrodyta, kad šis metodas negali visiškai inaktyvuoti HBV, HCV, ŽIV. Įrodyta, kad sausas terminis apdorojimas 80 laipsnių ir 72 val. buvo veiksmingas inaktyvuojant HBV, HCV ir ŽIV. Taip pat neseniai buvo gauta pranešimų apie liofilizuotus krešėjimo faktorių preparatus, apdorotus 100 laipsnių kampu. Xu Jinbo ir kt. gydė IgG 100 laipsnių temperatūroje 30 minučių ir inaktyvuotą vezikulinio stomatito virusą 8.2 Log. Kai kurie žmonės užšaldys išdžiovintą FVIII 68 laipsnių temperatūroje 72 valandas, sausą būseną, o po to kaitins 100 laipsnių temperatūroje 0,5–1 val. Šis metodas yra palyginti ekonomiškas.

 

4. Fotocheminis metodas

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Ląstelių, susijusių su ŽIV, skaičius ir trombocitai išliko geri po 7 dienų funkcinio išsaugojimo in vitro, kurį patvirtino FDA klinikiniams tyrimams.

Tarp šių metodų Pasteur dezinfekcijos metodas ir S/D metodas yra patvirtinti Jungtinių Valstijų FDA ir yra plačiai naudojami pasaulyje. Sauso karščio inaktyvavimo metodas daugiausia tinka liofilizuotų preparatų virusų inaktyvavimui. Fotocheminis metodas turi stiprų lipidais padengtų virusų inaktyvavimo poveikį ir buvo naudojamas visos plazmos virusų inaktyvavimui Europoje ir turi plačias viruso inaktyvavimo kraujo ląstelių komponentuose perspektyvas. Tačiau visi šie metodai turi savų trūkumų, pavyzdžiui, Pasteur sterilizacija nėra ideali kai kuriems karščiui atspariems virusams inaktyvuoti; S/D metodas negalėjo veiksmingai inaktyvuoti nelipo dengto viruso. Fotocheminis metodas gerokai pakenkė kai kurių plazmos baltymų aktyvumui. Dabartinis klinikinis tolesnių tyrimų taikymas rodo, kad joks viruso inaktyvavimo metodas negali garantuoti, kad kraujo produktai būtų visiškai apsaugoti nuo virusų perdavimo rizikos.

 

I. Viruso šalinimo procesas

Gaminant kraujo produktus, vienas inaktyvavimo procesas negali inaktyvuoti visų virusų; Be to, pats virusas yra heterologinis baltymas, pvz., įvedimas su produktu sukels nepageidaujamas reakcijas; Tuo pačiu metu dėl techninio lygio apribojimų vis dar yra virusų, kurių charakteristikos nėra randamos ar nesuprantamos, todėl esami virusų inaktyvavimo būdai negali garantuoti šių virusų inaktyvavimo efekto. Todėl vien inaktyvavimas negali garantuoti gaminio saugumo ir turi būti pašalintas iš gaminio. Taigi virusų šalinimo technologija sulaukia vis daugiau dėmesio. Toliau trumpai aprašyti du dažniausiai naudojami ir veiksmingi virusų šalinimo procesai.

1. Chromatografijos technologija

Chromatografijos technologija reiškia įvairių komponentų ir stacionarių fazių giminingumo ar sąveikos skirtumų naudojimą, siekiant atskirti įvairius komponentus. Pati chromatografija, kaip pažangi kraujo produktų gamybos technologija, pašalina virusus, ypač afininė chromatografija ir jonų mainų chromatografija. Naudojant jonų mainų chromatografiją, eliuavimas turi pranašumų prieš įsiskverbimą pašalinant virusą. 2 lentelėje parodyta duomenų apie HAV pašalinimo greitį naudojant chromatografinę technologiją, kai Australijos CSL kompanija gamina albuminą. Kaip matyti iš 2 lentelės, jonų mainų chromatografija ir gelio filtravimas yra veiksmingesni šalinant HAV, o bendras pašalinimo greitis yra 10,9 log.

Gamindama FVIII, „Baxter Healtheare“ atlieka imunoafininę chromatografiją, naudodama anti-FVIII antikūnais apdorotus gelius, kurie gali pašalinti (4,2±0.1)Log ir (5,3±0.9)Log iš ne - lipidais padengtų virusų, tokių kaip PPV ir HAV, atitinkamai.

 

2. Nanoplėvelės filtravimas

Kai kuriems mažo paviršiaus skersmens virusams, tokiems kaip HAV ir parvovirusas B19, nanomembraninis filtravimas yra efektyviausias pašalinimo būdas. Virusams išskirti naudojamas baltymų ir virusų dydžio skirtumas ir virusų adsorbcija per filtro membraną. Sanquin Blood Supply Site Nyderlanduose buvo atliktas laboratorinis virusų pašalinimo tyrimas, pridedant vieno etapo dviejų pakopų Planova 15N nanomembranos filtravimą į protrombino komplekso gamybos procesą. Nustatyta, kad po nanomembraninės filtravimo ŽIV, HAV ir kitų virusų pašalinimo greitis įvairiais laipsniais padidėjo (žr. 3 lentelę).

Tačiau taikant šį metodą pramoninėje gamyboje gali kilti tokių problemų: Pirma, dėl didelio gaminio klampumo ir didelio skersmens baltymų, filtro pasirinktos membranos porų dydis neturėtų būti per mažas, taip ribojamas mažo skersmens virusų, tokių kaip HCV, pašalinimas; Antra, membranos porų dydžio kontrolės stabilumas filtrų gamybos procese turės įtakos viruso pašalinimui. Trečia, kai užblokuojama membranos anga, mažesnė už viruso dalelės skersmenį, produkto srautas sumažės, o tai turės įtakos derliui. Todėl membranų, kurių savybės ir porų dydis atitinka perdirbtų produktų poreikius, parinkimas yra svarbus veiksnys, lemiantis, ar nanomembraninis filtravimas gali pašalinti virusus.

 

3. Diskusija

Siekiant užtikrinti kraujo šaltinio kokybę, viruso inaktyvavimo ir pašalinimo procesas yra svarbi ir būtina priemonė kraujo produktų saugumui užtikrinti. Vieno inaktyvuoto viruso proceso naudojimas negali visiškai garantuoti kraujo produktų saugumo. Remiantis viruso inaktyvavimo technologija, buvo pridėta virusų pašalinimo technologija, tokia kaip chromatografija ir nanoplėvelių filtravimas, viruso pašalinimo greitis buvo labai padidintas, o viruso inaktyvavimo ir pašalinimo efektas buvo žymiai pagerintas. Šiuo metu Europa aiškiai pasiūlė, kad kraujo produktų gamybos procese, siekiant užtikrinti kraujo produktų saugumą, turi būti atliktas bent vienas virusų inaktyvavimas ir pašalinimas.

Kinijoje dauguma kraujo produktų gamintojų gamybos procese naudoja tik vieną inaktyvuoto viruso procesą, pvz., Pasteur dezinfekcijos metodą, S/D metodą ir kt., tačiau nenaudoja viruso šalinimo proceso, o tai labai paveikia kraujo produktų kokybę. Kinijai įstojus į PPO, vietinių kraujo produktų gamybos procesas ir kokybės standartai atitiks pasaulinius, kitaip ji negali garantuoti esamos vidaus rinkos dalies, bet taip pat negalės konkuruoti su panašiais produktais kitose šalyse. tarptautinė rinka.

Todėl Kinijos kraujo produktų gamintojai turi tobulinti gamybos procesą, stiprinti viruso inaktyvavimą ir pašalinimą, kad būtų visiškai užtikrinta produkto kokybė ir saugumas. Todėl Kinijos kraujo produktų gamintojai bus tendencija naudoti chromatografiją kraujo produktams valyti ir virusams pašalinti, kad būtų užtikrintas kraujo produktų saugumas.

 

Apie Guidlingą

 

„Guidling Technology“ yra nacionalinė aukštųjų technologijų įmonė, daugiausia dėmesio skirianti biofarmacijai, ląstelių kultūrai, biomedicinos valymui ir koncentracijai, diagnostikai ir pramoniniams skysčiams. Sėkmingai sukūrėme išcentrinius filtrų įrenginius, ultrafiltravimo ir mikrofiltravimo kasetes, virusų filtrą, TFF sistemą, giluminį filtrą, tuščiavidurį pluoštą ir kt. Kurie visiškai atitinka biofarmacijos, ląstelių kultūros ir tt taikymo scenarijus. Mūsų membranos ir membraniniai filtrai yra plačiai naudojami koncentruojant, ekstrahuojant ir atskiriant išankstinį filtravimą, mikrofiltravimą, ultrafiltravimą ir nanofiltravimą. Mūsų daugybė produktų linijų, nuo mažo vienkartinio laboratorinio filtravimo iki gamybos filtravimo sistemų, sterilumo tyrimų, fermentacijos, ląstelių kultūros ir kt., atitinka bandymų ir gamybos poreikius. Guidling Technology laukia bendradarbiavimo su jumis!