Literatūros dalis|Atsisveikink su sudėtingu apsivalymu? Naujas TFF + paviršiaus aktyviosios medžiagos metodas pagerina efektyvumą ir sumažina AAV vektorių gamybos sąnaudas

Genų terapija sparčiai vystosi, tačiau jos didelės išlaidos išlieka pagrindinė kliūtis, užkertanti kelią platesnei pacientų prieigai. Tarp pagrindinių šios kainos variklių yra sudėtingas „Adeno“ gamybos procesas - susijęs viruso (AAV) vektoriai. Biotechnologijų ir bioinžinerijos atliktame tyrime buvo sukurtas naujas valymo metodas, derinantis tangentinio srauto filtravimą (TFF) su paviršiaus aktyviosiomis medžiagomis, o tai žada supaprastinti AAV valymo procesą ir sumažinti išlaidas. Pasinerkime į šį tyrimą, kuriam vadovavo Tokijo universiteto komanda.

 

1. Tyrimo pagrindas: iššūkiai ir dabartinė AAV valymo būklė

AAV vektoriai tapo „žvaigždžių“ pristatymo priemonėmis genų terapijoje dėl jų didelio saugumo, mažo imunogeniškumo, gebėjimo užkrėsti tiek dalijimąsi, tiek ne - dalijimosi ląsteles ir ilgą - termino geno ekspresiją. Tačiau jų gamybos procesas yra sudėtingas, ypač pasroviui valymo etapai, kurie paprastai apima kelis centrifugavimo ir chromatografijos raundus. Šie metodai yra laikas - vartojimas, darbas - intensyvus, sunkiai mastelio keitimas ir brangus.

Laboratoriniu mastu gryninimas dažnai priklauso nuo cezio chlorido arba jodiksanolio tankio gradiento ultracentrifugavimo, o tai sudėtinga masto pramoninei gamybai. Afiniteto chromatografija vis dažniau naudojama, tačiau mažos pH eliuavimo sąlygos, kurios jai reikia, gali pakenkti viruso užkrečiamumui. Todėl labai svarbu sukurti paprastą, efektyvų, švelnų ir keičiamą AAV valymo metodą.

Tangentinio srauto filtravimas (TFF) yra dydis - pagrįstas atskyrimo technika, paprastai naudojama koncentruoti ir buferiui - keičiantis bioproduktais. Tačiau įprastas TFF turi ribotą gebėjimą pašalinti priemaišas, tokias kaip ląstelių baltymai -šeimininkai (HCP) ir DNR AAV gryninimo metu, dažnai paliekant baltymų agregatus.

 

2. Novatoriškas požiūris: TFF kartu su paviršiaus aktyviosiomis medžiagomis, kad būtų galima efektyviai valyti

To overcome the limitations of traditional TFF, researchers Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa, and colleagues at the University of Tokyo devised a clever strategy: using surfactants to inhibit aggregation and interaction of impurity proteins, allowing them to pass through the TFF ultrafiltration membrane (500 kDa molecular weight cutoff) while retaining AAV viral particles (~25 nm dydžio).

Jie išbandė trijų rūšių paviršiaus aktyviosios medžiagos:

• Ne - joninis:Octyl gliukozidas
• Anijonas:Natrio deokiocholatas
• Zwitterionic:Chaps

Tyrimo metu nustatyta, kad vien tik ne - joninės paviršiaus aktyviosios medžiagos naudojimas buvo neveiksmingas. Tiek anijoninis natrio deokiocholatas, tiek Zwitterionic Chaps žymiai padidino likutinių baltymų pašalinimą, ir jie buvo nukreipti į skirtingas baltymų populiacijas. Galų gale, derinant 0,5% natrio deokiocholato su 1% Chaps, davė puikių rezultatų, beveik visiškai pašalinant likusius šeimininko baltymus. SDS - puslapio analizė parodė tik tris skaidrus AAV kapsido baltymų juostas (VP1/VP2/VP3).

 

1 paveikslas. TFF valymo procesas be paviršiaus aktyviųjų medžiagų;(a) SDS - puslapio gelio elektroforezė; b) perdavimo elektronų mikroskopija (TEM)

 

1 paveikslas. TFF gryninimo procesas su paviršiaus aktyviosiomis medžiagomis;(A) SDS - puslapio gelio elektroforezė; b) Transmisijos elektronų mikroskopija (TEM)

 

3. Tyrimo rezultatai: didelis grynumas, veikla ir saugumas

1. Efektyvus priemaišų pašalinimas:Naujas metodas pasiekė 99,98% HCP pašalinimą ir 95% DNR pašalinimą, kai grynumas yra panašus į afiniteto chromatografijos ar viršijimą.
2. Patobulintas užkrėtimas:In vitro eksperimentai parodė, kad AAV1 vektoriai, išgryninti naudojant šį metodą, efektyviau užkrėstos HEK293 ląstelėse nei tie, kurie išgryninti afiniteto chromatografija (24,9%, palyginti su 20,8%), tai rodo, kad geriau išsaugoti viruso biologinį aktyvumą.
3. Geras saugumas in vivo:Po vietinio išgrynintų AAV1 vektorių injekcijos į pelių skeleto raumenis, po dviejų savaičių reikšmingo uždegimo ar audinių pažeidimo nepastebėta, parodant gerą in vivo saugumą.
4. Platus serotipo pritaikymas:Metodas sėkmingai išgrynino kelis serotipus -, įskaitant AAV1, AAV5, AAV8 ir AAV9-FROM ląstelių kultūros supernatantus. Tačiau AAV2, kuris daugiausia egzistuoja ląstelių lizatuose, turinčiuose didelę priemaišų apkrovą, reikalingas tolesnis optimizavimas.

 

4. Santrauka ir perspektyva

Šis tyrimas sukūrė paprastą, greitą (1,5 valandos), efektyvų ir keičiamą naują AAV valymo procesą. Derinant natrio deoksiocholatą ir Chapsą, jis sėkmingai išsprendė likutinės baltymų agregacijos iššūkį TFF gryninimo metu.

Metodo pranašumai apima:

• Vengiant atšiaurių žemų pH sąlygų, geriau išsaugoti viruso aktyvumą
• Sumažinti chromatografijos žingsnius, supaprastinti darbo eigą ir taupyti laiką bei išlaidas
• Lengvai keičiamas, tinkamas dideliam pramonei - mastelio gamybai
• Pateikiama nauja kitų biomakromolekulių, tokių kaip egzosomos, kiti virusai, ir rekombinantinių antikūnų, valymo strategija

Dabartiniai apribojimai apima neoptimalų viruso atkūrimą ir nesugebėjimą atskirti tuščių kapsidų nuo pilnų virusinių dalelių, o tai rodo, kad geriausias jo naudojimas gali būti pirmasis - žingsnio fiksavimas daugialypėje - žingsnio valymo darbo eigoje.

Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas siūlo patrauklų naują AAV vektoriaus gamybos variantą ir gali žymiai sumažinti genų terapijos vaistų sąnaudas, palengvindamas jų platesnį pritaikymą.