Rekombinantinio Escherichia coli didelio tankio fermentacijos lizato išaiškinimo proceso tyrimas

 

Siekiant sumažinti medžiagos skysčio trukdžius chromatografijai ir pagerinti tikslinio baltymo išgavimą, buvo tiriamas dviejų rekombinantinių Escherichia coli padermių didelio tankio fermentacijos lizato nuskaidrinimo procesas. Buvo atrinktos BL21-HP1036 ir BL21-palA padermės, ekspresuojančios pagrindinius Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis genus. Baltymų išeigai įvertinti drumstumo ir elektroforezės būdu buvo naudojamas tangentinio srauto procesas, didelio greičio centrifugavimo procesas ir membraninių kasečių nuskaidrinimo procesas.

 

Rezultatai parodė, kad BL21-HP1036, BL21-palA didelio tankio fermentacijos lizatas, ekspresuojantis pagrindinius Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis genus, buvo nuskaidrintas filtruojant ir centrifuguojant membranos kasetėje, o baltymų išeiga viršija 80 proc. kurios galėtų veiksmingai sumažinti chromatografinius trukdžius ir pagerinti atkūrimo greitį.

 

Įvadas

Šiuo metu kiaulių ūkiuose dažniausiai pasitaikantys bakterinių ligų sukėlėjai yra Streptococcus suis (SS) ir Haemophilus parasuis (HPS), kurie kiaulininkystei atneša didelius nuostolius. SS iš viso galima suskirstyti į 35 serotipus 1-34 ir 1/2, o HPS galima suskirstyti į 1-15 serotipus, ir jie dažnai yra mišrūs, daugiausia sukeliantys kiaulių poliserozitą, artritą, meningitą, endokarditą. , bakterinė septicemija ir bronchitas.

 

Dėl didelio Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis serotipų skaičiaus skirtingų serotipų kryžminė apsauga yra silpna, o atsparumas antibiotikams, gydant antibiotikais, žymiai padidės, o tai turės įtakos gydomajam poveikiui.

 

Vakcinos tapo viena iš veiksmingų SS ir HPS prevencijos priemonių. Yra inaktyvuotos vakcinos, susilpnintos vakcinos, gyvos vakcinos, subvienetinės vakcinos ir genetiškai modifikuotos vakcinos, tačiau inaktyvuotos vakcinos ir susilpnintos vakcinos yra daugiausia rinkoje, o jų imuninė apsauga yra gera, tačiau kryžminė apsauga nėra akivaizdi. Subvienetinė vakcina yra naujo tipo vakcina nuo streptococcus suis, kuri yra naujo tipo vakcina, pasižyminti stipria kryžmine apsauga ir maža kaina. Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis subvienetinių vakcinų tyrimai ir plėtra yra puikus sprendimas Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis prevencijos ir kontrolės problemoms, kurios kankina kiaulių pramonę Kinijoje.

 

Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis subvienetinės vakcinos yra fermentuojamos didelio tankio rekombinantine Escherichia coli. Lizato išaiškinimas turi didelį poveikį tikslinių baltymų išeigai, tačiau yra keletas atitinkamų pranešimų. Svarbus darbas yra tai, kaip realizuoti fermentacijos ir gryninimo proceso nuskaidrinimo etapą. Šiame darbe rekombinantinės E. coli BL21-HP1036, BL21-palA didelio tankio fermentacijos tikslas – ištirti, kaip efektyviai sumažinti skaidrinančio tirpalo drumstumą, pagerinti baltymų išeigą, Streptococcus suis subvieneto vakcinos fermentacijos procesas, skirtas pramoniniam smulkinimo ir skaidrinimui, siekiant suteikti teorinį pagrindą ir techninę pagalbą.

 

1. Medžiagos ir metodai

1.1 Medžiagos

 

1.1.1 Įtempimai

Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis padermės BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Pagrindinės terpės ir reagentai

Mielių ekstraktas ir kiaulė; natrio chloridas; Kanamicinas, IPTG; Formaldehidas iš; SDS-PAGE gelio rinkinys.

 

1.1.3 Pagrindinė bandymo įranga

didelio tankio fermentatorius; Didelio greičio centrifuga; Elektroforezės aparatai; Ultravioletinė gelio vaizdavimo sistema; Ultragarsinis smulkintuvas; Maža didelio greičio centrifuga; Ultravioletinis spektrofotometras; Pastovios temperatūros kratymo stalas; Afininės chromatografijos įranga.

 

1.2 Metodai

 

1.2.1 Didelio tankio fermentacijos kultūra

Kvalifikuotos rekombinantinės koliforminės padermės BL21-HP1036 ir BL21-pa-lA buvo pasėtos sintetinėje terpėje 2 % (V/V) ir auginamos 37 laipsnių temperatūroje 35-40 val.

 

1.2.2 Rekombinantinio baltymo sukelta ekspresija

Kai fermentacijos tirpalas OD{{0}}±0,1, prasidėjo indukcija, indukcijos temperatūra buvo 35 laipsniai ± 0,5 laipsnio ir kultūra buvo baigta po 10 valandų indukcijos.

 

1.2.3 Aukšto slėgio vienalytis smulkinimas ir centrifugavimas

Bakterijų skystis, kuris išlaikė inaktyvavimo testą, buvo susmulkintas aukšto slėgio homogenizatoriumi, kad būtų galima sulaužyti ląsteles, esant 100–150 MPa slėgiui. Susmulkinus, susmulkintas skystis buvo laikomas žemoje temperatūroje.

Supernatantas buvo gautas centrifuguojant dideliu greičiu, išcentrinis greitis: 15000 aps./min, temperatūros valdymas: 10 laipsnių ~ 15 laipsnių, įpurškimo greitis: atitinkamai 0,5 ~ 1 l/min., supernatantas buvo surinktas ir supernatantas buvo užpildytas talpyklomis, kurios pašalino endotoksiną.

 

1.2.4 Mikrofiltravimo membranos kasetės nuskaidrinimas

Membrana buvo plaunama 1 0L išgryninto vandens viena kryptimi ir buvo atliktas tangentinis srauto filtravimas. 300 ml suskaidytos bakterijų suspensijos po centrifugavimo buvo paimta iš vamzdyno centrifugos ir skaidrinama 0,45 um mikrofiltracinės membranos kasete. Drumstumas buvo išmatuotas atitinkamai imant mėginius ir lyginamas drumstumas po centrifugavimo, mikrofiltravimo membranos kasetėje esančio skaidraus skysčio drumstumas ir mikrofiltravimo membranos kasetėje esančio koncentruoto skysčio drumstumas. Baltymų kiekis mėginyje buvo aptiktas chromatografijos ir elektroforezės būdu, siekiant įvertinti baltymų išeigą.

 

2 veiksmas: rezultatai

2.1 BL21-HP1036 ir BL21-palA baltymo patikslinimo duomenys ir tyrimų rezultatai

Rezultatai Fig. 1 parodyta, kad BL21-HP1036 ir BL21-palA rekombinantinio Escherichia coli trupinimo skysčio drumstumas sumažėjo nuo 4 500 NTU ir 4 000 NTU atitinkamai iki 1970 NTU ir 520 NTU, po mėgintuvėlio centrifugavimo. BL21-HP1036 ir BL21-palA rekombinantinių Escherichia coli drumstumas buvo sumažintas iki 25 NTU ir 1,28 NTU mikrofiltravimo membranos kasečių metodu. Galima pastebėti, kad mikrofiltravimo membranos kasetės tangentinio srauto filtravimo ir optimizuoto atviro srauto kanalo naudojimas turi gerą poveikį endotoksino, chromatografinio skysčio klampumo ir drumstumo mažinimui nei tradicinis centrifuginis filtravimas ir gali žymiai sumažinti sulaužytą rekombinantinį E. coli heteroproteiną. ir nukleino rūgšties.

 

2.2 BL21-HP1036 ir BL21-palA mėginių baltymų atkūrimas

1 lentelėje parodyta, kad rekombinantinis Escherichia coli BL21-HP1036 baltymas yra ir mikrofiltravimo skaidrintame tirpale, ir koncentruotame supernatante, padengtame mikrofiltravimo membrana, ir bendra baltymų išeiga, atėmus baltymą iš mikrofiltravimo skaidrinto tirpalo ir koncentruoto supernatanto. yra apie 88,5%. BL21-palA baltymas taip pat buvo mikrofiltravimo eksudato nuskaidrintame tirpale ir koncentruoto tirpalo supernatante, padengtame mikrofiltravimo membranos kasete. Bendra BL21-PALa baltymo išeiga buvo 81,5%.

 

3. Išvada

Šiame darbe padermės, ekspresuojančios pagrindinius Streptococcus suis ir Haemophilus parasuis genus BL{{0}}HP1036 ir BL21-palA, buvo atitinkamai fermentuojami didelio tankio ir praėjo 0,45. Medžiagos skysčio drumstumas buvo žymiai sumažino um mikrofiltravimo membranos kasetės procesą, o tai rodo, kad tangentinio srauto filtravimo technologija naudojant mikrofiltravimo membranos kasetę buvo geresnė nei naudojant greitaeigę centrifugą ir gali žymiai sumažinti suskaidytos rekombinantinės Escherichia coli baltymų ir nukleino rūgšties priemaišų kiekį.

 

Surinkus skaidrų skystį į vieną mikrofiltravimo membranos kasetę, buvo 62,9 %, nes 37,1 % tikslinio BL21-HP1036 baltymo buvo mikrofiltravimo koncentratas arba buvo mikrofiltravimo membranos kasetėje ir kitų nuostolių. , paaiškinimui buvo priimtas dviejų etapų metodas. Pirmajame etape eksudatui nuskaidrinti ir surinkti buvo panaudota 0,45 um mikrofiltravimo membranos kasetė; antrajame etape po mėgintuvėlio centrifugavimo buvo surinktas likęs koncentruotas skystis, o dviejų pakopų skaidrintas skystis buvo sujungtas kaip chromatografinis mėginys. BL21-palA fermentacijos skysčio drumstumas reikšmingai nepadidėjo, baltymų išeiga galėjo pasiekti daugiau nei 85,5%, o BL21-Pala fermentacijos skysčio baltymų išeiga po dviejų etapų apdorojimo gali siekti 81,5%.

 

Kalbant apie mikrofiltravimo membranos kasetės pasirinkimą, Guidling Technology gali pasiūlyti aukštos kokybės sprendimus. Mūsų mikrofiltravimo membraninių kasečių ir ultrafiltravimo membraninių kasečių serijos gaminiuose kaip nešiklis naudojamas polieterio sulfonas, specialiai sukurtas biotechnologijoms. Mūsų polieterio sulfono membrana pasižymi dideliu pralaidumu, maža baltymų adsorbcija, dideliu mechaniniu stiprumu, atsparumu smūgiams ir pan. Mes suteikiame jums specialius membraninius spaustukus, kad realiu laiku išmatuotų įėjimo ir išleidimo angos slėgį, ir galime atlikti techninius apsilankymus pagal jūsų poreikius, kad pritaikytumėte specialią ultrafiltravimo / mikrofiltravimo sistemą. Tokia maža tangentinio srauto sistema gali būti naudojama mažos, bandomosios ir nedidelės apimties gamybai ir gali būti visiškai linijinis stiprinimas, kad visiškai atitiktų jūsų bandymo ir gamybos reikalavimus.

Apie Guidlingą

„Guidling Technology“ yra nacionalinė aukštųjų technologijų įmonė, daugiausia dėmesio skirianti biofarmacijai, ląstelių kultūrai, biomedicinos valymui ir koncentracijai, diagnostikai ir pramoniniams skysčiams. Sėkmingai sukūrėme išcentrinius filtrų įrenginius, ultrafiltravimo ir mikrofiltravimo kasetes, virusų filtrą, TFF sistemą, giluminį filtrą, tuščiavidurį pluoštą ir kt. Kurie visiškai atitinka biofarmacijos, ląstelių kultūros ir tt taikymo scenarijus. Mūsų membranos ir membraniniai filtrai yra plačiai naudojami koncentruojant, ekstrahuojant ir atskiriant išankstinį filtravimą, mikrofiltravimą, ultrafiltravimą ir nanofiltravimą. Mūsų daugybė produktų linijų, nuo mažo vienkartinio laboratorinio filtravimo iki gamybos filtravimo sistemų, sterilumo tyrimų, fermentacijos, ląstelių kultūros ir kt., atitinka bandymų ir gamybos poreikius. Guidling Technology laukia bendradarbiavimo su jumis!