Kaip pasirinkti tinkamą ultrafiltracijos vamzdelį

Ultrafiltracijos vamzdeliai, paprastai naudojami baltymų koncentracijai ir buferio pakeitimui, dažnai naudojami ultrafiltracijos vamzdeliuose. Yra ir kitų modelių, turinčių skirtingus tūrio dydžius ir ultrafiltracijos vamzdelius, priklausomai nuo tikslinio baltymo molekulinės masės, tūrio prieš koncentraciją ir tikslinio koncentracijos tūrio. Daugkartinio naudojimo.

1. Pasirinkite tinkamą ultrafiltracijos vamzdelį, daugiausia atsižvelgiant į MWCO ir koncentracijos tūrį. Paprastai molekulinė masė neturėtų būti didesnė kaip 1 / 3 tikslinio baltymo molekulinės masės. Jei tikslinio baltymo molekulinė masė yra apie 10 kd, galima naudoti ultrafiltracijos vamzdelį, kurio molekulinė masė yra 3 KD.

2. Naujai įsigyta ultrafiltracija yra sausa. Prieš naudojimą įpilkite milikų vandens. Vanduo visiškai praeina per membraną ir kelias minutes iš anksto įšaldomas ledo vonioje arba šaldytuve. Tada išpilkite vandenį, kad pridėtumėte baltymų tirpalą. Baltymų tirpalo kiekis neturi viršyti baltos linijos mėgintuvėlio viršuje. Lengvas veikimas. Prieš pridedant baltymų tirpalą, ultrafiltracijos vamzdis turi būti įdėtas į ledą, kad būtų galima iš anksto atvėsti.

3. Balansas. Gravitacijos masė ir centras turi būti subalansuoti. Atkreipkite dėmesį, kad greitis ir pagreitis neturėtų būti per greitas, kitaip ultrafiltracijos membrana bus tiesiogiai pažeista. Pradėkite išcentrinę ultrafiltraciją (prieš atšaldydami centrifugą iki 4 laipsnių). Diafragmos ir besisukančio veleno kryptį galima reguliuoti pagal instrukcijas (kampo centrifugos atveju diafragma yra statmena velenui). Faktinio naudojimo metu bendras greitis yra mažesnis nei nurodyta vadove, o tai gali pailginti išcentrinio vamzdžio tarnavimo laiką.

4. kai sutelktas į likusį 1ml, [paimkite 50ul namų Bradford tirpalą, įpilkite 10ul skysčio, kad pamatytumėte, ar jis tampa mėlynas, ir nustatykite, ar ultrafiltracijos vamzdis nutekėjo baltymą. Jei vamzdis nutekėja, supilkite jį į viršutinį sluoksnį ir tada grįžkite į naują vamzdelį, kad pradėtumėte ultrafiltraciją. Norėdami tiksliai nustatyti, ar mėgintuvėlis nutekėjo, prašome 5mg 10min centrifugą 10min, tada praeikite pro jį, paleiskite baltymų gelį arba Bradfordą] [šiurkštus matavimas]. Toliau pridėkite likusį baltymų tirpalą, kad sutelktumėte dėmesį (dirbkite ant ledo, kad išvengtumėte baltymų šildymo), kol bus pridėti visi koncentruoti tirpalai. Centrifugacijos metu atkreipkite dėmesį į tai, ar atsiranda baltymų kritulių ir sukelia vamzdžių užsikimšimą. Jei atsiranda kritulių, nustatykite konkrečią kritulių priežastį, ar baltymų koncentracija yra per didelė, ar buferis yra netinkamas; Pirmasis gali būti išspręstas naudojant kelis ultrafiltracijos vamzdelius tuo pačiu metu, kad sumažėtų koncentracija, o pastarasis gali pakeisti skirtingus buferius, kol baltymas nusodins.

5. Ankstesni žingsniai naudojami baltymų koncentravimui. Jei buferis turi būti pakeistas, kai bendras baltymų tirpalas yra sutelktas į maždaug 1ml, švelniai įpilkite naują buferį (ultrafiltracija per 0,22um ultrafiltracijos membraną), o po to tris kartus nuolat koncentruokite į maždaug 1 ml, kad galutinė koncentracija priklausytų nuo reikiamos baltymų koncentracijos, kuri paprastai yra ne didesnė kaip 500ul arba mažesnė nei 200ul. Pagal tūrio koncentraciją ne mažiau kaip 10 kartų kiekvieną kartą, tai yra daugiau nei 1000 kartų didesnė nei tris kartus, o tai iš esmės gali pasiekti buferio keitimo tikslą.

6. Pašalinkite galutinį baltymų koncentratą. Dirbkite ant ledo. Naudodami geltoną pipetės antgalį (200ul), švelniai įkiškite pipetės antgalį išilgai krašto, tada švelniai pūskite ir sumaišykite baltymų tirpalą. Būkite atsargūs, kad neliestumėte ultrafiltracijos membranos. Kiekvieną kartą čiulpkite koncentruotą tirpalą iki 200ul, kol jis bus visiškai įsiurbtas. Nereikia ištraukti paskutinio koncentruoto tirpalo mėgintuvėlio apačioje, kitaip tai yra per sunku ir ultrafiltracijos membrana gali būti pažeista. Galiausiai į ultrafiltracijos vamzdelį pridedamas miliq vanduo, nepraeinant per ultrafiltracijos membraną, kad būtų išvengta vandens praradimo ir membranos džiovinimo.

7. Toliau pateikiami ultrafiltracijos vamzdžio apdorojimo ir ultrafiltracijos vamzdžio pakartotinio naudojimo žingsniai.

8. Supilkite vandenį į ultrafiltracijos vamzdelį ir kelis kartus švelniai nuplaukite milikų vandeniu. [jei mėgintuvėlio apačioje yra akivaizdžių baltymų kritulių, pirmiausia galite pridėti vandens ir tada jį išpūsti pipete. Būkite atsargūs, kad neliestumėte membranos. Nuosėdos pakimba žemyn ir tada pabėga. Jūs negalite jo nuplauti vandentiekio vandeniu. Pridėjus 0,2 m NaOH tirpalą, padėkite jį kambario temperatūroje 20 minučių ir per šį laikotarpį subalansuokite ultrafiltracijos vamzdelį. Centrifuga dar 10 minučių. Supilkite likusį NaOH tirpalą ir panardinkite medvilnės šerdį į stiklinę (1 arba 2L) Milliq vandenį, padėkite kelias valandas, o po to pakeiskite nauju vandeniu, padėkite kelias valandas, kad nuolat atskiestumėte NaOH koncentraciją. Nuplaukite 50 ml mėgintuvėlį ir uždenkite vandentiekio vandeniu ir nuplaukite vidinę sieną milieko vandeniu.

9. Išimkite panardintą mėgintuvėlio šerdį, įpilkite ją į visą milikų vandenį, tada užpildykite 50 ml mėgintuvėlį milieko vandeniu. Lėtai įdėkite vamzdžio šerdį į 50 ml.

Centrifugų vamzdis, nusausinkite ir padalinkite vandenį, tada uždenkite ir laikykite 4 laipsnių temperatūroje iki kito naudojimo. Apskritai, atsižvelgiant į pirmiau minėtus veiksmus ir atsargumo priemones, kiekvienas vamzdis nesulūš per trejus ar ketverius metus.