Pagrindiniai kietosios{0}}fazės peptidų sintezės (SPPS) principai ir darbo eiga

Kietosios{0}}fazės peptidų sintezė (SPPS)yra peptidų sintezės ant kieto pagrindo metodas. Pagrindinės SPPS strategijos apimaBoc metodasirFmoc metodas. Peptidų sintezė yra pasikartojantis nuoseklaus aminorūgščių pridėjimo procesas ir paprastai atliekamas išC-galas (karboksilo galas)prieN-galas (amino galas). Pirma, tikslinio peptido pirmosios aminorūgšties karboksilo grupė yra kovalentiškai prijungta prie kieto pagrindo (dervos). Naudojant šios aminorūgšties amino grupę kaip pradinį tašką, N-galo apsauginė grupė pašalinama, o auganti peptidinė grandinė pailginama reaguojant su aktyvuotos antrosios aminorūgšties pertekliumi. Šis ciklas-sujungimas → plovimas → apsaugos pašalinimas → neutralizavimas ir plovimas → kitas sujungimas- kartojamas tol, kol pasiekiamas norimas peptido ilgis. Galiausiai peptidinė grandinė atskeliama nuo dervos ir išgryninama, kad būtų gautas tikslinis peptidas. Kai -amino grupė yra apsaugotaBoc (tret-butiloksikarbonilas), metodas vadinamasBoc{0}}pagrįsta kietosios{1}}fazės peptidų sintezė. Kai -amino grupė yra apsaugotaFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonilas), jis žinomas kaipFmoc{0}}pagrįsta kietosios{1}}fazės peptidų sintezė.

 

Boc{0}}pagrįsta kietosios-fazės peptidų sintezė (Boc metodas)

ĮBoc metodas, Boc grupės, pašalinamos trifluoracto rūgštimi (TFA)yra naudojami -amino grupėms apsaugoti, tuo tarpubenzilo -tipo apsaugos grupėsnaudojami šoninėms grandinėms. Sintezės metu Boc-apsaugota -aminorūgštis pirmiausia kovalentiškai sujungiama su derva. Po to Boc grupė pašalinama TFA, o gautas laisvas amino galas neutralizuojamas trietilaminu. Kita aminorūgštis aktyvuojama naudojantDCC (dicikloheksilkarbodiimidas)ir sujungtas, kad pratęstų peptidinę grandinę. Pabaigus surinkimą, tikslinis peptidas atskiriamas nuo dervos naudojant stiprią rūgštį, paprastaibevandenis vandenilio fluoridas (HF)arbatrifluormetansulfonrūgštis (TFMSA).Taikant Boc sintezės metodą, prieš kiekvieną sujungimo etapą reikia pakartotinai apdoroti rūgštimi, kad būtų pašalintos apsauginės grupės. Tai gali sukelti keletą šalutinių reakcijų, tokių kaip priešlaikinis peptido skilimas iš dervos ir aminorūgščių šoninių grandinių nestabilumas rūgščiomis sąlygomis, dėl kurių gali atsirasti nepageidaujamų šalutinių reakcijų.

 

Fmoc{0}}pagrįsta kietosios-fazės peptidų sintezė (Fmoc metodas)

Į1978, Meienhoferis ir Athertonassukūrė peptidų sintezės strategiją, naudodamasFmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonilas)kaip -amino apsauginė grupė, žinoma kaipFmoc metodas. Taikant šį metodą, -amino grupė yra apsaugotabazinis-labiles Fmoc, o šoninės grandinės yra apsaugotosrūgščių-labiųjų Boc-tipo apsauginių grupiųPagrindinis Fmoc, kaip amino-apsauginės grupės privalumas yra taistabilumas rūgštinėmis sąlygomis; jo neveikia gydymas reagentais, pvztrifluoracto rūgštis (TFA)ir gali būti pasirinktinai pašalintas naudojantšvelnus pagrindas. Tuo pačiu metu šoninės grandinės apsauginės grupės, tokios kaip Boc, yra stabilios esant bazinėms sąlygoms ir pašalinamos rūgštiniu būdu. Galiausiai peptidas kiekybiškai atskiriamas nuo dervos naudojantTFA/dichlormetanas (DCM), vengiant naudoti stiprias rūgštis ir taip pagerinti saugumą bei suderinamumą su įprastine peptidų sinteze.

 

Kietosios{0}}fazės peptidų sintezės (SPPS) raidos istorija

1.Pagrindinis etapas (XX amžiaus pradžia iki 1963 m.)

Į1902, Emilis Fišerisbuvo pirmasis, ištyręs peptidų sintezę, tačiau pažanga buvo lėta dėl techninių apribojimų. Naudota ankstyvoji sintezėbenzoilo ir acetilo apsauginės grupės, kuriuos buvo sunku pašalinti ir kurie dažnai sukeliapeptidinės grandinės skilimas.

Į1932, Maksas Bergmanasir bendradarbiai{0}} pristatėbenziloksikarbonilo (Z) grupėkaip -amino apsauginė grupė. Šią grupę galima pašalinti pagalkatalizinis hidrinimas arba rūgštinės sąlygos, suteikdamas patikimesnį peptidų sintezės įrankį ir padėdamas pagrindą kietosios -fazės peptidų sintezei septintajame dešimtmetyje.

Per1950s, mokslininkai sėkmingai susintetino įvairiasbiologiškai aktyvūs peptidai, pvzoksitocinas ir insulinas. Šie pasiekimai dar labiau patobulino peptidų chemiją ir sukūrė pagrindą kietosios -fazės peptidų sintezei.

 

2. Novatoriškas etapas (1963)

Į1963, Robertas B. Merrifieldaspasiūlėkietosios -fazės peptidų sintezės (SPPS) metodas, kuriameC-galinė aminorūgštisyra pritvirtintas prie dervos atramos, o peptidinė grandinė pailgėja per pasikartojančius ciklusapsaugos pašalinimas ir sujungimas. Šis metodas labai supaprastino peptidų sintezės procesą ir tapopageidaujamas metodaspeptidų surinkimui.

Merrifieldas naudojoBoc (tret-butiloksikarbonilas)apsaugoti -amino grupę. Iki septintojo dešimtmečio pabaigos jis taip pat sukūrėpirmasis visiškai automatizuotas peptidų sintezatoriusir sėkmingai susintetintasbiologiniai baltymaitokie kaipribonukleazė (124 aminorūgštys). Už šiuos novatoriškus pasiekimus Merrifieldas buvo apdovanotasNobelio chemijos premija 1984 m.

 

3. Technologinių inovacijų etapas (1972 m.)

Į1972, Lou Carpinosukūrė9-fluorenilmetiloksikarbonilo (Fmoc) apsauginė grupė, kuris gali būtišvelniai pašalinamas pagrindinėmis sąlygomis, sumažina nepageidaujamas reakcijas. Dėl to jis ypač tinkakompleksiniai peptidaiirautomatizuota sintezė.

TheFmoc metodaspalaipsniui pakeitė Boc metodą kaip pagrindinę strategiją. Automatiniai peptidų sintezatoriai, pagrįsti abiemFmoc ir Boc chemijavėliau buvo sukurti, vairuodamipeptidų sintezės automatizavimasir labai pagerina efektyvumą bei atkuriamumą.

 

4. Brandos ir plėtros etapas (1990 m. iki dabar)

Dervos ir reagento optimizavimas:Plėtradidelės-apkrovos, hidrofilinės PEG-modifikuotos dervosir veiksmingi sukabinimo reagentai, tokie kaipHBTUirHATUžymiai pagerino kietosios -fazės peptidų sintezės (SPPS) efektyvumą ir išeigą.

Technologinė integracija:Nauji požiūriai kaipsintezė su mikrobangų{0}}pagalbairsrauto chemijasutrumpino reakcijos laiką ir dar labiau padidino derlių.

 

Pagrindiniai SPPS principai ir darbo eiga:
Pagrindinis kietosios{0}}fazės peptidų sintezės principas yralaipsniškas peptidinės grandinės konstravimas ant kieto pagrindo, naudojantapsaugoti grupės strategijasirkondensacijos (sujungimo) reakcijospasiektiefektyvus ir kontroliuojamas peptidų surinkimas.

1. Kietosios atramos (dervos) vaidmuo kietosios{1}}fazės peptidų sintezėje (SPPS)

A netirpi polimerinė derva-pavyzdžiuipolistireno -divinilbenzeno-susieta derva, Wang derva arba Rink amido derva-pasirinktas kaip tvirtas SPPS palaikymas. Dervos paviršiuje yrafunkcines grupes(pvz., hidroksilo arba amino grupes), kurios gali susidarytikovalentiniai ryšiai su vienu peptidinės grandinės galu, paprastaiC-galas, pritvirtindamas peptidą prie kietos atramos. Šis kovalentinis tvirtinimas užtikrina, kad augantis peptidasvisos sintezės metu lieka surištas su derva, kuris labaipalengvina tolesnius reakcijos etapus, plovimą ir valymą

 

2. Grupės strategijos apsauga kietosios{1}}fazės peptidų sintezėje (SPPS)

Vykstant peptidų sintezei,-aminogrupė, karboksilo grupė ir reaktyviosios pusės-grandinės funkcinės grupėsaminorūgščių (pvz., tiolio, karboksilo ir amino grupių) yra linkę įšalutinių reakcijų. Kad išvengtumėte šių nepageidaujamų reakcijų,apsaugančios grupėsyra naudojami. Įprastos apsauginės grupės yra:-Aminosauginės grupės:

Boc (tret{0}}butiloksikarbonilas):Rūgštis-labi, lengvai pašalinamarūgštinės sąlygos.

Fmoc (9-fluorenilmetiloksikarbonilas):Stabilus rūgštinėmis sąlygomis, gali būti pašalintaspagrindinės sąlygos(pvz., piperidino/DMF tirpalas).Šoninės{0}}grandinės apsaugos grupės:Parenkamos pagal aminorūgščių šoninės grandinės chemines savybes.įprastos grupės apimabenzilas (Bn), tret{0}}butilas (tBu), tritilas (Trt)ir tt Šios grupės yrapašalintas sintezės pabaigoje, dažniausiai peptido skilimo iš dervos metu, naudojantrūgšties ar kitų specifinių sąlygų.

 

3.C-Terminus į N-termino sintezė naudojant SPPS

Įkietosios{0}}fazės peptidų sintezė (SPPS), peptidų surinkimas paprastai prasidedaC-galas (karboksilo galas)ir palaipsniui juda linkN-galas (amino galas). Taip yra todėl,C-galinė aminorūgštis pirmiausia pritvirtinama prie kieto pagrindo, o vėlesnės aminorūgštys yra susietos sulaisvoji peptidinės grandinės amino grupė, jau susieta su derva, palaipsniui ilginant peptidinę grandinę.

 

4. Sujungimo reakcija kietosios{1}}fazės peptidų sintezėje (SPPS)

Apsaugotos aminorūgštys turi būtiaktyvuotakad jųkarboksilo grupės tampa reaktyvios, leidžianti jiems suformuoti apeptidinė jungtissu derva{0}}susieto peptido amino grupe. Dažnasaktyvuojantys reagentaiįtrauktikarbodiimidai(pvz., DCC, DIC),HOBt, HATU, irPyBOP. Kai aktyvuota, karboksilo grupė reaguoja su laisva aminogrupe akondensacijos reakcija, sudarant anamido jungtisir taip prijungiant naują aminorūgštį prie augančios peptidinės grandinės.

 

5. Pasikartojančios (ciklinės) operacijos kietosios{1}}fazės peptidų sintezėje (SPPS)

Procesas apimakartojant apsaugos pašalinimo → sujungimo → plovimo ciklą, pridedantviena aminorūgštis per cikląpalaipsniui pailginti peptidinę grandinę. Po kiekvienosujungimo reakcija, derva yranuplauti(pvz., su tirpikliais, tokiais kaip DMF arba DCM), kad pašalintų nesureagavusius reagentus, šalutinius produktus ir aminorūgščių perteklių. TheTada pašalinama naujai pridėtos liekanos -amino grupė, atskleidžiant laisvą aminą, kad būtų galima pasiruošti kitai sujungimo reakcijai. Šis ciklas kartojamas tol, kol bus visiškai surinkta norima peptidų seka.

 

6. Skilimas kietosios{1}}fazės peptidų sintezėje (SPPS)

Kai peptidinė grandinė pasiekia norimą ilgį, ji yraatskilo nuo kietos atramosnaudojant atitinkamą reagentą, tuo pačiu metupašalinant visas apsaugines grupes. Dažniausiai naudojamas skilimo reagentas yratrifluoracto rūgštis (TFA), kuri ne tiknutraukia ryšį tarp peptido ir dervosbet irpašalina apsaugines grupespvz., Fmoc ir Boc, atkuriant peptidą iki jogimtoji valstybė. Kai peptidinė grandinė pasiekia norimą ilgį, ji yraatskilo nuo kietos atramosnaudojant atitinkamą reagentą, tuo pačiu metupašalinant visas apsaugines grupes. Dažniausiai naudojamas skilimo reagentas yratrifluoracto rūgštis (TFA), kuri ne tiknutraukia ryšį tarp peptido ir dervosbet irpašalina apsaugines grupespvz., Fmoc ir Boc, atkuriant peptidą iki jogimtoji valstybė.

Atlikdami šiuos veiksmus,kietosios{0}}fazės peptidų sintezė (SPPS)įgalinaefektyvus ir kontroliuojamas peptidinių grandinių surinkimas ant kieto pagrindo, išvengiant sudėtingų tarpinių valymo etapų, reikalingų atliekant tradicinę tirpalo{0}}fazės sintezę ir daugsintezės efektyvumo ir derlingumo gerinimas.

Atlikdami šiuos veiksmus,kietosios{0}}fazės peptidų sintezė (SPPS)įgalinaefektyvus ir kontroliuojamas peptidinių grandinių surinkimas ant kieto pagrindo, išvengiant sudėtingų tarpinių valymo etapų, reikalingų atliekant tradicinę tirpalo{0}}fazės sintezę ir daugsintezės efektyvumo ir derlingumo gerinimas.