Atsargumo priemonės naudojant ultrafiltravimo vamzdelį
(1) Pasirinkite tinkamą ultrafiltravimo vamzdelį. Paprastai išlaikoma molekulinė masė neturi būti didesnė nei 1/3 tikslinio baltymo molekulinės masės. Pavyzdžiui, jei tikslinio baltymo molekulinė masė yra 35 kDa, galima pasirinkti ultrafiltravimo vamzdelį, kurio molekulinė masė yra 10 kDa. Jei tikslinio baltymo molekulinė masė yra apie 10 kd, galima naudoti ultrafiltravimo vamzdelį, kurio molekulinė masė yra 3 kD. Atidžiai perskaitykite naudojimo instrukciją ir atkreipkite dėmesį į skirtingą ultrafiltravimo membranos toleranciją įvairioms cheminėms medžiagoms.
(2) Naujai įsigytas ultrafiltravimas yra sausas. Prieš naudojimą įpilkite itin gryno vandens ir vanduo visiškai praeis per membraną. Iš anksto atvėsinkite ledo vonelėje arba šaldytuve keletą minučių. Tada išpilkite vandenį ir įpilkite baltymų tirpalo. Pridedamas kiekis neturi viršyti baltos linijos tūbelės viršuje. Operacija turi būti lengva. Prieš įpilant baltymų tirpalo, ultrafiltravimo vamzdelį reikia įkišti ant ledo, kad būtų galima atvėsinti.
(3) Likutis. Tiek masė, tiek svorio centras turi būti subalansuoti. Atkreipkite dėmesį, kad greitis ir pagreitis neturėtų būti per greiti, kitaip ultrafiltravimo membrana bus tiesiogiai pažeista. Pradėkite centrifuginį ultrafiltravimą (išankstinis centrifugos aušinimas iki 4 laipsnių). Po to, kai skirtingų centrifugų RPM paverčiamas į G, jis skiriasi. Sureguliuokite centrifugos pagreitį į žemiausią pavarą, kad sumažintumėte slėgį ant membranos. Atkreipkite dėmesį, kad prieš išeidami iš centrifugos turite palaukti, kol centrifuga pasieks nustatytą greitį, nes priešingu atveju, iškilus centrifugos problemai, pirmą kartą su ja susitvarkyti nepavyks. Membranos ir sukimosi veleno kryptis turi būti sureguliuota pagal instrukcijas (jeigu centrifuga sukasi kampu, membrana yra statmena velenui). Praktikoje greitis paprastai yra mažesnis nei nurodytas vadove, o tai gali pailginti išcentrinio vamzdžio tarnavimo laiką.
(4) Kai jis susikoncentruoja iki likusio 1 ml, paimkite 50 ul buferinio tirpalo ir įpilkite 10 ul, kad pratekėtų, kad pamatytumėte, ar jis pasidaro mėlynas, kad nuspręstumėte, ar iš ultrafiltravimo vamzdelio neišteka baltymo. Jei vamzdelis prateka, supilkite viršutinį sluoksnį ir pratekėkite per naują vamzdelį ir pradėkite ultrafiltravimą. Norėdami tiksliai nustatyti, ar mėgintuvėlyje nėra nuotėkio, centrifuguokite su 5 mg ml BSA 10 min., tada praleiskite srautą, paleiskite baltyminius klijus arba Bradfordą, kad apytikriai išmatuotų, ir toliau pilkite likusį baltymo tirpalą, kad koncentruotumėte (dirbkite ant ledo, kad baltymas nepatektų). kaitinama), kol bus supilti visi koncentruoti tirpalai. Atkreipkite dėmesį, ar centrifuguojant nenusėda baltymai, dėl kurių vamzdis užsikemša. Jei atsiranda kritulių, nustatykite konkrečią kritulių priežastį, ar baltymų koncentracija per didelė, ar buferis netinkamas; Pirmąjį galima išspręsti vienu metu ultrafiltruojant keliais ultrafiltravimo vamzdeliais, siekiant sumažinti koncentraciją. Pastarasis yra keisti skirtingus buferinius tirpalus tol, kol baltymas nenusėda.
(5) Ankstesni veiksmai naudojami baltymams koncentruoti. Jei norite pakeisti buferį, kai bendras baltymų tirpalas susikoncentruoja iki maždaug 1 ml, švelniai įpilkite naujo buferio (ultrafiltravimas per 0,22 um ultrafiltravimo membraną) ir tris kartus iš eilės koncentruokite iki maždaug 1 ml. Galutinis paskutinės koncentracijos tūris priklauso nuo reikiamos baltymų koncentracijos, kuri paprastai yra ne didesnė kaip 500 ul, arba ji gali būti koncentruota iki mažesnės nei 200 ul. Pagal tūrio koncentraciją bent 10 kartų kiekvieną kartą, ji gali pasiekti daugiau nei 1000 kartų tris kartus, o tai iš esmės gali pasiekti tikslą pakeisti buferį.
