TaikymasUltrafiltracijaEištraukimas išNprigimtinisCOllagenas

 

Ⅰ.Kas yra kolagenas

Kolagenas yra biopolimeras, pagrindinis gyvūnų jungiamojo audinio komponentas, taip pat gausiausias ir plačiausiai paplitęs funkcinis baltymas žinduolių organizme, sudaro 25–30 % viso baltymo, o kai kuriuose – net daugiau nei 80 %. organizmai. Jis atlieka surišančio audinio vaidmenį gyvūnų ląstelėse.

Pagal matavimus, suaugusio žmogaus organizme yra apie 3 kg kolageno, kurio daugiausia yra odoje, kauluose, akyse, dantyse, sausgyslėse, vidaus organuose (įskaitant širdį, skrandį, žarnyną ir kraujagysles) ir kitose kūno dalyse. žmogaus kūno. Jo funkcija – palaikyti odos ir organų morfologiją ir struktūrą, taip pat tai svarbi žaliava pažeistiems audiniams atstatyti.

II. Kolageno ekstrahavimas iš amūrų žvynų ultrafiltracijos būdu

1. Medžiagos ir metodai

1.1 Bandomieji pavyzdžiai

Vandeninis žalio kolageno ekstraktas.

1.2 Bandymo metodai

1.2.1 Ultrafiltravimo procesas

1.2.2 Pirminio filtravimo proceso nustatymas

Šiame bandyme optimalus išankstinio filtravimo procesas nustatomas lyginamąja vakuuminio filtravimo metodo ir mikrofiltravimo metodo analize. Konkretūs bandymo metodai yra tokie:

① Neapdorotas kolageno vandeninis ekstraktas filtruojamas filtravimo popieriumi vakuuminio filtravimo metodu, kad būtų pašalintos suspenduotos dalelės ir priemaišos vandeniniame ekstrakte.

② Neapdorotas kolageno vandeninis ekstraktas filtruojamas naudojant 0,2 μm mikrofiltravimo membraną, kad vandeniniame ekstrakte būtų pašalintos netirpios medžiagos, priemaišos ir kt.

1.2.3 Ultrafiltracinės membranos porų dydžio pasirinkimas

Valymo metu ultrafiltravimo membranos porų dydis yra 100 kDa.

1.2.4 Ultrafiltravimo gryninimo proceso vieno faktoriaus eksperimentas

Vandeninis neapdoroto kolageno ekstraktas yra išgrynintas ultrafiltravimo technologija. Ištirkite vieno veiksnio eksperimentą dėl darbinio slėgio, darbinės temperatūros ir pH įtakos kolageno sulaikymui. Tam tikrą laiką paleidę ultrafiltravimo įrangą, ištirkite įvairių veiksnių įtaką kolageno sulaikymo greičiui.

1.2.5 Skaičiavimo formulė

2. Rezultatai ir analizė

2.1 Priešfiltravimo proceso analizė

Žemiau esančioje lentelėje rasite vakuuminio filtravimo metodo ir mikrofiltravimo metodo palyginimo rezultatus.

Filtravimo metodas	Tirpalo koncentracija prieš filtravimą/(g/l)	Tirpalo koncentracija po filtravimo/(g/l)	Sensoriniai reiškiniai
vakuuminio filtravimo metodas	0.45	0.35	Tirpalas yra skaidrus filtravimo pabaigoje, tačiau tam tikrą laiką paliekamas drumstas.
mikrofiltravimo metodas	0.45	0.42	Tirpalas yra skaidrus filtravimo pabaigoje ir išlieka skaidrus, kai paliekamas tam tikrą laiką

 

Iš lentelės matyti, kad tiek vakuuminio filtravimo metodu, tiek mikrofiltravimo metodu galima pašalinti tirpale esančias priemaišas ir netirpias kietąsias medžiagas, tačiau mikrofiltravimo metodas geriau apsaugo baltymus, tai yra, nuostoliai nėra reikšmingi ir vakuuminio filtravimo metodas gali sukelti baltymų nuostolius. Be to, tam tikrą laiką vakuuminiu filtravimu padėtas filtratas yra drumstas, o mikrofiltravimas vis dar skaidrus ir skaidrus, todėl mikrofiltravimas pasirenkamas kaip išankstinio ultrafiltravimo procesas.

2.2 Ultrafiltravimo proceso vieno faktoriaus testas

2.2.1 Ultrafiltravimo slėgio įtaka sulaikymo greičiui

Esant 40 laipsnio temperatūrai ir pH 9.0, ištirkite skirtingų ultrafiltravimo slėgių (0.07MPa, 0) poveikį. {11}}9 MPa, 0,11 MPa, 0,13 MPa ir 0,15 MPa) dėl baltymų sulaikymo greičio. Rezultatai pateikti paveikslėlyje žemiau.

 

Kaip matyti iš aukščiau pateikto paveikslo, didėjant darbiniam slėgiui, baltymų perėmimo greitis palaipsniui mažėjo. Esant {{0}}.07MPa, baltymų sulaikymo greitis yra 96,53%, kai darbinis slėgis yra 0,15 MPa, baltymų sulaikymo greitis yra 84,38%. Taip yra todėl, kad medžiagų atskyrimą ultrafiltruojant lemia slėgio skirtumas. Esant tokiam žemo darbinio slėgio diapazonui, mažos molekulinės medžiagos gali greitai prasiskverbti pro membraną, tačiau stambiamolekulinės medžiagos gali būti sulaikomos ultrafiltracijos membranos ir kauptis membranos paviršiuje, o šiuo metu – membranos paviršiuje ir vandeninėje terpėje. ištraukti formos koncentracijos skirtumą, kad susidarytų koncentracijos skirtumo poliarizacija; tačiau didėjant slėgiui, koncentracijos poliarizacinis pasipriešinimas palaipsniui didėja, o koncentracijų skirtumas tarp membranos paviršiaus ir vandeninio ekstrakto pasiekia pusiausvyrą. Kai slėgis viršija šią pusiausvyrą, ant membranos paviršiaus gali būti užrašytas gelio sluoksnis (tai atitiko koncentracijos poliarizacijos ir ultrafiltravimo metu susidariusio gelio sluoksnio teoriją). Slėgis ir toliau didėja, o gelio sluoksnio storis didėja, o membranos paviršiuje lieka baltymų, todėl sulaikymo greitis yra mažas. Siekiant užtikrinti membranos atskyrimo efektą, optimalus darbinio slėgio parametras yra 0,07 MPa.

2.2.2 Temperatūros įtaka baltymų sulaikymo greičiui

Esant slėgiui {{0}},11 MPa, pH 9,0, ištirkite skirtingų temperatūrų (25 laipsnių, 30 laipsnių, 35 laipsnių, 40 laipsnių ir 45 laipsnių) poveikį baltymų sulaikymui. Rezultatai pateikti paveikslėlyje žemiau.

 

Kaip parodyta aukščiau esančiame paveikslėlyje, didėjant temperatūrai, ultrafiltravimo membranos sulaikymo greitis palaipsniui didėja ir pasiekia maksimalų 45 laipsnių kampą, o sulaikymo greitis yra 97,01%. Kadangi kolageno klampumas yra glaudžiai susijęs su temperatūra: kai temperatūra žemesnė, kolageno klampumas yra didesnis, todėl kolagenui lengva suformuoti atsparumą membranos paviršiuje, todėl sulaikymo greitis yra mažas. Kylant temperatūrai, mažėja kolageno klampumas ir susilpnėja kolageno molekulių sąveika, todėl padidėja masės perdavimo greitis ir susilpnėja koncentracijos poliarizacija, todėl padidėja sulaikymo greitis. Kita sulaikymo greičio padidėjimo priežastis yra ta, kad pakyla temperatūra, atitinkamai didėja kolageno tirpumas, sumažėja kolageno blokavimo membraną reiškinys. Todėl optimali ultrafiltravimo temperatūra yra 45 laipsniai.

2.2.3 pH įtaka baltymų sulaikymui

Esant slėgiui {{0}},11 MPa ir 40 laipsnio temperatūrai, ištirkite skirtingų pH sąlygų poveikį, būtent pH=6.0, pH{ {5}}.{{10}}, pH=8,0, pH=9,0 ir pH=10,0, dėl sulaikymo greičio . Rezultatai pateikti paveikslėlyje žemiau.

 

As shown in the above figure, within the pH value range of 6–7, with the increase of pH value, the protein retention rate decreases, and there is a minimum value of 82.13% at pH=7.0. When pH>7, with the increase of pH value, the retention rate gradually increases. This is because the isoelectric point of collagen pH=7, at the isoelectric point of protein is a precipitation state, easy to stay on the surface of the membrane block membrane, so that the retention rate is low; When pH>7, sulaikymo greitis palaipsniui didėja didėjant pH. Taip yra todėl, kad ultrafiltravimo membrana yra polieterio klevo membrana su neigiamu krūviu, kolagenas su neigiamu krūviu šarminėje aplinkoje, neigiamą krūvį turinčios kolageno molekulės ir ultrafiltravimo membrana su tuo pačiu krūviu sudaro viena kitą nesuderinamą būseną, todėl kolageno molekulėms nėra lengva išlikti ant paviršiaus. membranos, nėra lengva užblokuoti membraną, todėl optimalus ultrafiltravimo pH yra 8-10.

2.3 Ultrafiltravimo proceso optimizavimas ir rezultatų patvirtinimas

Design-Expert8.05 programinės įrangos analizė rodo, kad optimalūs proceso parametrai yra tokie: darbinis slėgis 0,14 MPa, darbinė temperatūra 40,98 laipsniai ir tirpalo pH=9,43. Tokiomis sąlygomis išlaikymo rodiklis buvo 92,551 %. Atsižvelgiant į faktinių parametrų veikimą, darbinis slėgis yra 0,14 MPa, darbinė temperatūra yra 40 laipsnių, o tiekimo skysčio pH vertė yra 9,50 ultrafiltravimo sąlygomis. Eksperimentinė patikra pradedama pradėjus stabilizuoti ultrafiltravimo įrenginio sistemą. Gautas sulaikymo rodiklio rezultatas yra (92.61 0.1)% (n=3). Numatoma lygties reikšmė iš esmės yra panaši į išmatuotą vertę, kuri rodo, kad prognozuojamas sąlyginio parametro rezultatas atitinka faktinį sąlyginį rezultatą.

2.4 Elektroforezės analizės rezultatai

Išgrynintas kolagenas analizuojamas SDS-PAGE elektroforeze, o rezultatai pateikti paveikslėlyje žemiau.

Kaip parodyta aukščiau esančiame paveikslėlyje, 1 juosta yra išgrynintas kolagenas šiame eksperimente, o 2 juosta yra standartinis blauzdos sausgyslės kolageno pavyzdys. Iš SDS-PAGE elektroforezės buvo matyti, kad šiame eksperimente pasiūlytas kolageno baltymas gali būti identifikuojamas kaip kolagenas, tačiau iš pažiūros neaiškios a1 peptidų grandinės ir a2 peptidų grandinės ribos nėra aiškios. Iš elektroforezės aišku, kad kitų baltymų juostų nėra, galima daryti išvadą, kad išgryninto kolageno grynumas yra didelis.